草鱼感染嗜水气单胞菌miRNA筛选及其功能分析

发布时间：2017-09-01 20:31

  本文关键词：草鱼感染嗜水气单胞菌miRNA筛选及其功能分析

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【摘要】：草鱼(Ctenopharyngodon idellus)产量及产值在最近几年一直位居我国和世界养殖鱼类前列。人工养殖条件下的草鱼病害较多,提高草鱼抗病力是增加养殖产量的重要途径之一。草鱼抗病性能差异与遗传有关。从转录组水平探索草鱼易感和抗病群体间的差异表达基因,对于解析不同群体间的差异及揭示形成该差异的分子机理具有重要作用。本论文通过嗜水气单胞菌人工感染草鱼,分别构建草鱼易感和抗病群体。利用高通量测序技术分析草鱼易感和抗病群体肾脏脾脏中的差异表达mi RNA和m RNA。筛选其中的关键mi RNA和m RNA,对其调控关系和功能进行分析鉴定。主要研究结果如下:1.草鱼易感和抗病群体转录组测序分析利用Hiseq 2000技术平台对草鱼易感和抗病群体肾脏脾脏文库进行高通量测序,在易感和抗病群体文库分别获得了7.09 G和6.13 G数据量。对测序数据进行过滤、拼接和组装后共获得199,554个转录本,其中28,311个转录本注释为己知功能蛋白。在草鱼易感和抗病群体中共有721个显著差异表达的基因。相对于易感群体,在抗病群体中有475个差异基因为上调表达,246个为下调表达。生物学功能和信号通路富集分析表明,差异表达基因主要富集到免疫相关信号通路。2.草鱼易感和抗病群体脾脏关键mi RNA筛选鉴定利用Hiseq 2000技术平台对草鱼脾脏易感与抗病群体2个small RNA文库进行高通量测序和表达模式分析。通过比对mi Rbase 19.0数据库,获得61个已知mi RNA,预测得到124个新mi RNA。分析这185个mi RNA表达情况,表明mi R-451在易感群体中表达量最高,mi R-101a在抗病群体中表达量最高,cid-mi Rn-85在两个群体中的差异倍数最大(4.12倍)。在草鱼易感和抗病群体中,共发现21个mi RNA表达情况具有显著差异,其中5个mi RNA在易感群体显著高表达,16个在抗病群体显著高表达。21个差异表达mi RNA共预测得到287个靶基因,对这些靶基因的功能进行富集发现其中有35条通路与免疫功能相关。对草鱼易感群体中高表达的5个mi RNA进行后续分析。草鱼组织表达模式分析表明,lei-7i和cid-mi Rn-118在免疫相关组织肾脏和脾脏高表达,cid-mi Rn-3和mi R-451在血液中高表达。细菌感染草鱼过程中,let-7i、cid-mi Rn-118、cid-mi Rn-3和mi R-451均呈现出动态表达模式。使用mi Randa软件预测lei-7i和cid-mi Rn-118在草鱼中的潜在靶基因。利用双荧光素酶报告系统和过表达试验,验证lei-7i和cid-mi Rn-118通过靶向Citlr4和Cinfil3-6基因3‘非编码区抑制Citlr4和Cinfil3-6基因表达。组织表达谱分析发现,草鱼Citlr4基因在脾脏和肾脏中显著高表达。细菌和病毒均可影响Citlr4的表达水平。过表达草鱼Citlr4基因可以激活下游免疫相关基因il-1β,il-8和TNF-α。3.草鱼易感和抗病群体肾脏关键mi RNA筛选鉴定利用Hiseq 2000技术平台对草鱼肾脏易感和抗病群体2个small RNA文库进行高通量测序和表达模式分析。通过比对mi Rbase 19.0数据库,获得97个已知mi RNA,预测到95个新mi RNA。分析这192个mi RNA的表达情况,发现mi R-101a在易感和抗病群体中的表达量均为最高,cid-mi Rn-154在两个群体中的差异倍数最大(5.19倍)。在草鱼易感和抗病群体中,共发现9个mi RNA表达情况具有显著差异,其中3个mi RNA在易感群体高表达,6个在抗病群体高表达。9个差异表达mi RNA共预测得到188个靶基因,对这些靶基因的功能进行富集发现有26条与免疫功能相关。对草鱼易感和抗病群体中9个差异表达mi RNA进行后续分析。草鱼组织表达谱分析表明,他们在6个免疫相关组织中均有表达。使用mi Randa软件对靶基因进行预测,发现mi R-142a-3p、mi R-21、mi R-223、cid-mi Rn-115和cid-mi Rn-131在Citlr5基因的3’UTR区域均有靶位点。进行草鱼组织表达谱和草鱼肾细胞受鞭毛蛋白刺激实验分析,结果表明mi R142a-3p、cid-mi Rn-115与Citlr5的表达模式呈负相关。草鱼肾细胞中过表达mi R-142a-3p和cid-mi Rn-115,结果表明Citlr5基因表达水平被抑制。组织表达谱分析发现,Citlr5基因在肝脏和脾脏中显著高表达。在草鱼肾细胞中,细菌和病毒均可影响Citlr5的表达水平。在草鱼肾细胞中,过表达草鱼Citlr5基因可以激活下游免疫相关基因il-1β、il-8和TNF-α。4.草鱼mi RNA内参基因筛选鉴定用2个常用的内参基因18s r RNA、β-actin和草鱼中高表达的7个mi RNA作为候选内参。使用ge Norm v.3.5、Norm Finder、Best Keeper和comparative deltaCt四种软件程序,对9个候选内参在草鱼18个胚胎发育阶段和12个组织的稳定性进行了计算。在未受精卵至原肠期阶段,mi R-126-3p显示最为稳定;在眼囊出现期至孵化后10天,mi R-22a最为稳定。确定了不同组织中的稳定表达的mi RNA:在血液和肝脏中最稳定的是mi R-126-3p,鳃中是mi R-101a,肾脏中是mi R-192,肠是mi R-451,在脑、头肾、脾脏、心脏、肌肉、皮肤和鳍条中mi R-22a最为稳定。
【关键词】：草鱼 细菌性败血症 Toll样受体信号通路 mi RNA
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S943
【目录】：

• 摘要4-7
• Abstract7-14
• 引言14-15
• 第一章 文献综述15-23
• 1.1 Toll样受体生物学功能15-17
• 1.1.1 TLR结构和分布15-16
• 1.1.2 TLR的模式识别作用16-17
• 1.2 TLR信号传递途径17-20
• 1.2.1 依赖MyD88 途径17
• 1.2.2 非依赖MyD88 途径17-18
• 1.2.3 TLR信号通路下游的炎性因子18-19
• 1.2.4 TLR信号通路的负向调控19-20
• 1.3 鱼类toll样受体的生物学功能研究20-21
• 1.3.1 鱼类TLRs的类型和结构特征20-21
• 1.3.2 鱼类TLR的配体特异性及其信号途径21
• 1.4 Toll样受体信号通路与细菌疾病相关的研究21-23
• 第二章 草鱼转录组表达谱分析23-46
• 2.1 材料23-25
• 2.1.1 草鱼样品23
• 2.1.2 细菌及细胞23-24
• 2.1.3 质粒和菌株24
• 2.1.4 主要试剂及耗材24-25
• 2.1.5 主要仪器设备25
• 2.2 方法25-29
• 2.2.1 嗜水气单胞菌感染草鱼半数致死浓度测定25-26
• 2.2.2 草鱼易感和抗病群体筛选26
• 2.2.3 总RNA提取26
• 2.2.4 草鱼易感和抗病群体脾脏肾脏转录组高通量测序26-27
• 2.2.5 实时荧光定量PCR27-29
• 2.2.6 数据统计学分析29
• 2.3 结果29-45
• 2.3.1 总RNA质量检测29-30
• 2.3.2 转录组组装结果和分析30-32
• 2.3.3 unigene功能注释和预测编码蛋白框32-34
• 2.3.4 GO功能分类和代谢通路分析34-36
• 2.3.5 Unigene表达差异分析36-39
• 2.3.6 miRNA与mRNA整合分析39-45
• 2.4 讨论45-46
• 第三章 草鱼易感和抗病群体脾脏关键miRNA筛选鉴定46-71
• 3.1 材料46
• 3.2 方法46-53
• 3.2.1 嗜水气单胞菌感染草鱼半数致死浓度的测定46-47
• 3.2.2 草鱼易感和抗病群体筛选47
• 3.2.3 总RNA提取47
• 3.2.4 草鱼易感和抗病群体脾脏small RNA高通量测序47-48
• 3.2.5 载体构建48-51
• 3.2.6 草鱼肾细胞系细胞培养51
• 3.2.7 CIK细胞转染51-52
• 3.2.8 双荧光素酶报告基因检测52
• 3.2.9 过表达目的基因对嗜水气单胞菌入侵CIK细胞的影响52-53
• 3.2.10 实时荧光定量PCR53
• 3.2.11 数据统计学分析53
• 3.3 结果53-66
• 3.3.1 草鱼脾脏易感和抗病small RNA测序质量及长度分布53-55
• 3.3.2 miRNAs差异表达分析55-58
• 3.3.3 miRNA靶基因预测及富集分析58-60
• 3.3.4 cid-miRn-118 和let-7i靶基因验证60-62
• 3.3.5 Citlr4 在不同组织中的表达情况62
• 3.3.6 Citlr4 在不同刺激情况下表达模式62-65
• 3.3.7 草鱼TLR4 对细菌侵袭的影响65
• 3.3.8 过表达CiTLR4 对下游基因表达的影响65-66
• 3.4 讨论66-71
• 第四章 草鱼易感和抗病群体肾脏关键miRNA筛选鉴定71-89
• 4.1 材料71
• 4.2 方法71-73
• 4.2.1 嗜水气单胞菌感染草鱼半数致死浓度的测定71
• 4.2.2 草鱼易感和抗病群体筛选71
• 4.2.3 总RNA提取71
• 4.2.4 草鱼易感和抗病群体肾脏small RNA高通量测序71-72
• 4.2.5 过表达载体构建72
• 4.2.6 草鱼肾细胞系细胞培养72
• 4.2.7 CIK细胞转染72
• 4.2.8 过表达目的基因对嗜水气单胞菌入侵CIK细胞的影响72
• 4.2.9 实时荧光定量PCR72
• 4.2.10 数据统计学分析72-73
• 4.3 结果73-86
• 4.3.1 草鱼肾脏易感和抗病群体small RNA测序数据质量及长度分析73-74
• 4.3.2 small RNA转录组定位和分类注释74-75
• 4.3.3 miRNA差异表达分析75-77
• 4.3.4 差异表达miRNA的qRT-PCR验证77-78
• 4.3.5 Citlr5 是cid-mi Rn-115 和miR-142a-3p的潜在靶基因78-80
• 4.3.6 Citlr5 调控mi RNA验证80-81
• 4.3.7 草鱼Citlr5 基因组织表达模式81-82
• 4.3.8 Citlr5 在不同刺激情况下表达模式82-84
• 4.3.9 CiTLR5, cid-miRn-115 和mi R-142a-3p对细菌侵袭的影响84
• 4.3.10 过表达CiTLR5 对下游基因表达的影响84-86
• 4.4 讨论86-89
• 第五章 草鱼内参miRNA筛选89-105
• 5.1 材料90-91
• 5.1.1 草鱼样品90-91
• 5.1.2 主要试剂及耗材91
• 5.1.3 主要仪器设备91
• 5.2 方法91
• 5.2.1 总RNA提取91
• 5.2.2 实时荧光定量PCR91
• 5.2.3 数据统计学分析91
• 5.3 结果91-102
• 5.3.1 内参基因初步筛选91-93
• 5.3.2 候选内参基因稳定性分析93-96
• 5.3.3 候选内参miRNA基因的表达水平分析96-97
• 5.3.4 内参基因验证97-102
• 5.4 讨论102-105
• 小结105-106
• 参考文献106-120
• 附录120-121
• 博士在读期间发表及投稿论文121-122
• 致谢122

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本文编号：774272