芽胞杆菌生物膜形成机制研究

发布时间：2017-09-06 18:06

  本文关键词：芽胞杆菌生物膜形成机制研究

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【摘要】：芽胞杆菌是农业生产中一类重要的根际促生菌(Plant Growth-Promoting Rhizobacteria, PGPR),可定殖于植物根部发挥生防功能,但其具体生防机理尚未清晰。已有研究证明很多芽胞杆菌“应答”外界环境信号形成生物膜,稳定定殖于植物根部。研究芽胞杆菌生物膜形成机制及调控途径,不仅有利于揭示其定殖及生防机理,而且为生物农药的研发提供理论指导,推动芽胞杆菌的产业化发展。本研究以两株生防菌蜡样芽胞杆菌905 (Bacillus cereus 905)和枯草芽胞杆菌NCIB 3610 (B. subtilis NCIB 3610)为研究对象,借助分子生物学技术,结合全基因组序列,系统研究了生物膜形成机制。本研究首次报道了蜡样芽胞杆菌在不同的培养基中利用不同的机制形成两种不同形式的生物膜；外界环境信号影响枯草芽胞杆菌中酪氨酸激酶／酪氨酸激酶调节器(EpsB/EpsA和PtkA/TkmA)之间的“交互应答”,在翻译后水平上调控EPS的表达,进而调控生物膜的形成。主要研究结果如下：(1)本研究通过对培养基的筛选和优化,证明了B. cereus 905可以在MSgg培养基空气-液体交界面形成薄皮型生物膜(pellicles),在TSBG培养基底部形成潜底型生物膜(submerged biofilms)。通过与枯草芽胞杆菌中生物膜基因进行核苷酸和氨基酸序列比对,鉴定了B. cereus 905基因组中含有生物膜基因的同源序列。通过B. cereus 905相关基因缺失突变体的构建,生物膜表型检测发现了：spo0A、sinI、sipW和calY基因参与薄皮型生物膜的形成,推测B. cereus905在MSgg培养基中形成薄皮型生物膜的机制可能和B. subtilis的相似；但是这些基因均不参与潜底型生物膜的形成,而弱酸性环境(pH≤6.5)是其形成的必需条件,推测B. cereus 905在TSBG培养基底部形成潜底型生物膜的机制可能和金黄色酿脓葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的相似。此外,我们还鉴定了B. cereus 905生物膜基质主要包含蛋白质和胞外DNA。蜡样芽胞杆菌在生物膜形成过程中并不诱导eps的表达,表明生物膜的形成不需要胞外多糖的参与.(2)已有研究证明酪氨酸激酶参与枯草芽胞杆菌生物膜的形成。B. subtilis NCIB 3610基因组中包含两组酪氨酸激酶／酪氨酸激酶调节器：EpsB/EpsA和PtkA/TkmA。本研究表明它们之间可以“交互应答”：TkmA不仅可以激活同源的PtkA,还可以激活非同源的EpsB。通过对缺失突变体表型检测证明了,在LBGM培养基中,tkmA缺失突变体(△tkmA)不能形成生物膜；然而在MSgg培养基中,△tkmA尽管造成了生物膜形态的改变,却不能抑制生物膜的形成,这表明了TkmA对于生物膜形成的重要性是营养依赖性的。在△tkmA中诱导EpsAB过量表达可以回补生物膜的形成,由此推测TkmA是通过调控EpsB影响生物膜的形成。基于AtkmA-ugd抑制突变子序列分析,通过测定lacZ报告菌株的活性证明SpoOA和DegU共同调控tkmA-ugd和epsA-O操纵子：在LBGM培养基中高活性的SpoOA和DegU促进TkmA的表达量升高,TkmA对于生物膜的形成发挥重要作用；在MSgg培养基中低活性的SpoOA和DegU促进EpsA的表达量升高,EpsA对于生物膜的形成表现出更为重要的作用。
【关键词】：芽胞杆菌 生物膜 tkmA pH 作用机制
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S476.1
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-8
• 缩略语表8-16
• 第一章 绪论16-56
• 1.1 细菌与生物膜概述16-17
• 1.1.1 细菌概念16
• 1.1.2 芽胞杆菌形态学特征16
• 1.1.3 生物膜概念16-17
• 1.2 细菌生物膜的形成、组成成分及生物学意义17-26
• 1.2.1 细菌生物膜形成条件17-21
• 1.2.2 与植物相关的生物膜21-23
• 1.2.3 细菌生物膜的组成结构23-25
• 1.2.4 细菌生物膜的作用25-26
• 1.3 细菌生物膜的生活史26-28
• 1.4 蜡样芽胞杆菌生物膜研究进展28-37
• 1.4.1 蜡样芽胞杆菌生物膜的形成方式及组成成分28-32
• 1.4.2 蜡样芽胞杆菌生物膜形成过程中的基因调控途径32-36
• 1.4.3 蜡样芽胞杆菌生物膜与生防的关系36-37
• 1.5 枯草芽胞杆菌生物膜研究进展37-52
• 1.5.1 枯草芽胞杆菌生物膜形成方式37-38
• 1.5.2 枯草芽胞杆菌生物膜基质组成成分38-42
• 1.5.3 枯草芽胞杆菌生物膜形成过程中的基因调控网络42-49
• 1.5.4 枯草芽胞杆菌生物膜的发展及消解49-50
• 1.5.5 生物膜在生防枯草芽胞杆菌生防中发挥的重要功能50-52
• 1.6 研究内容及目的意义52-56
• 1.6.1 研究内容52-53
• 1.6.2 研究目的与意义53-56
• 第二章 蜡样芽胞杆菌生物膜形成机制研究56-91
• 2.1 实验材料56-66
• 2.1.1 细菌菌株、质粒及培养条件56-59
• 2.1.2 酶和引物合成59-61
• 2.1.3 培养基及实验溶液配制61-65
• 2.1.4 主要实验仪器65-66
• 2.2 实验方法66-77
• 2.2.1 生物信息学分析66
• 2.2.2 大肠杆菌感受态细胞的制备66
• 2.2.3 B.cereus 905菌株感受态细胞的制备及电击转化66-67
• 2.2.4 B.cereus菌株基因组DNA的提取67-68
• 2.2.5 质粒DNA的小量提取68
• 2.2.6 缺失突变重组质粒的构建68-72
• 2.2.7 目标基因缺失突变体的构建及筛选72-74
• 2.2.8 功能互补载体的构建74-75
• 2.2.9 蜡样芽胞杆菌形成潜底型生物膜的定量分析75
• 2.2.10 蜡样芽胞杆菌形成潜底型生物膜的定性分析75
• 2.2.11 蜡样芽胞杆菌在MSgg中形成薄皮型生物膜的分析75-76
• 2.2.12 蜡样芽胞杆菌生物膜形成中pH的测定76
• 2.2.13 蜡样芽胞杆菌生物膜对Proteinase K和DNase I敏感性的测定76
• 2.2.14 蜡样芽胞杆菌芽孢的形成76-77
• 2.2.15 蜡样芽胞杆菌玻片的制备77
• 2.3 结果与分析77-88
• 2.3.1 B.cereus 905基因组中含有相关的生物膜基因77-81
• 2.3.2 B.cereus 905可以在MSgg中形成薄皮型生物膜81-83
• 2.3.3 促进905形成潜底型生物膜条件的筛选83-84
• 2.3.4 弱酸性条件是905形成潜底型生物膜的必需条件84-86
• 2.3.5 胞外DNA和蛋白是905生物膜的主要组成成分86-88
• 2.4 小结88
• 2.5 讨论88-91
• 第三章 枯草芽胞杆菌酪氨酸激酶调节器TkmA在生物膜形成过程中的功能研究91-131
• 3.1 实验材料91-98
• 3.1.1 菌株、质粒及培养条件91-95
• 3.1.2 酶和引物合成95-96
• 3.1.3 培养基与实验溶液配制96-98
• 3.2 实验方法98-112
• 3.2.1 大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒热激转化98
• 3.2.2 B.subtilis菌株基因组DNA的提取98-99
• 3.2.3 质粒DNA的小量提取99
• 3.2.4 枯草芽胞杆菌基因缺失突变体的构建99-103
• 3.2.5 枯草芽胞杆菌ΔtkmA突变体功能互补菌株的构建103
• 3.2.6 枯草芽胞杆菌ΔtkmA突变体epsA互补菌株的构建103-104
• 3.2.7 枯草芽胞杆菌ΔtkmA突变体点突变互补菌株的构建104-105
• 3.2.8 点突变菌株YC997,YC999,TG043,YC998,YC1200和TG044的构建105-107
• 3.2.9 组成型表达LacZ菌株的构建107-110
• 3.2.10 EpsAB过量表达菌株的构建110-111
• 3.2.11 抑制突变体YC820突变序列的确定111
• 3.2.12 β-半乳糖苷酶活性的测定111-112
• 3.2.13 枯草芽胞杆菌生物膜评价112
• 3.3 结果与分析112-127
• 3.3.1 tkmA-ugd操纵子调控区序列分析112-114
• 3.3.2 tkmA缺失突变体在LBGM培养基中形成生物膜的能力显著降低114-115
• 3.3.3 TkmA结构域的定点突变分析115-117
• 3.3.4 ΔtkmA-ugd的抑制突变体生物膜检测及序列分析117-119
• 3.3.5 单核苷酸突变降低sinR的表达量,显著地提高epsA-O的表达量119-120
• 3.3.6 过量表达EpsAB可以回补AtkmA或ΔtkmA-ugd造成的生物膜形成缺陷120-122
• 3.3.7 SpoOA和DegU对tkmA-ugd和epsA-O操纵子的复杂性调控122-125
• 3.3.8 tkmA在LBGM中的表达量高于在MSgg中的表达量,而epsA正好相反125-126
• 3.3.9 在LBGM和MSgg中DegU和Spo0A调节tkmA和epsA的表达量126-127
• 3.4 小结127-128
• 3.5 讨论128-131
• 第四章 结论与展望131-134
• 4.1 结论131-132
• 4.1.1 生物膜形成类型的多样性研究131
• 4.1.2 营养影响生物膜形成的研究131
• 4.1.3 蜡样芽胞杆菌生物膜形成机制研究131-132
• 4.2 本研究的创新性132
• 4.2.1 蜡样芽胞杆菌利用两种独立的机制形成生物膜132
• 4.2.2 TkmA在枯草芽胞杆菌生物膜产生过程中表现出新功能132
• 4.3 展望132-134
• 参考文献134-146
• 附录146-204
• 附录1——GenBank收录的Bacillus cereus 905的序列146-190
• 附录2——GenBank收录的Bacillus subtilis NCIB 3610的序列190-204
• 致谢204-206
• 作者简历206-208

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本文编号：804630