保护斑马鱼（Danio rerio）胚胎免受细菌感染的新型母源性LPS结合蛋白ZRANB2的鉴定

发布时间：2017-09-06 15:38

  本文关键词：保护斑马鱼（Danio rerio）胚胎免受细菌感染的新型母源性LPS结合蛋白ZRANB2的鉴定

  更多相关文章： 斑马鱼 胚胎 ZRANB2 母源性 LPS结合蛋白

【摘要】：斑马鱼是研究母源性免疫的重要模式生物,已经逐渐成为人们进行免疫学研究的新宠。本文采用高通量分离的方法从斑马鱼胚胎提取液中分离得到一个LPS结合蛋白-ZRANB2。ZRANB2普遍存在于各种生物体中,但是其功能和作用机制所知甚少。本文对ZRANB2进行了生物信息学分析、表达模式分析、体内体外抗菌活性研究以及抗菌活性中心的探寻,初步证明ZRANB2是一个母源性免疫因子。首先,本文分别在分子水平和蛋白水平,证明ZRANB2在斑马鱼各组织中都有表达,卵巢中表达量最高,在胚胎发育早期ZRANB2也大量存在,这说明其确实为一母源性蛋白。其次,通过序列比对发现,斑马鱼ZRANB2与哺乳动物、鸟类、两栖类和硬骨鱼的ZRANB2的一致性在氨基酸水平达到79.2%,80.3%,80.6%和82.3%,这说明ZRANB2的序列比较保守。经三维结构预测得知,斑马鱼ZRANB2与人ZRANB2结构相似,都主要由β折叠片层组成。再次,体外功能验证证明重组ZRANB2 (rZRANB2)作为模式识别受体可以识别细菌信号分子LPS,能与革兰氏阴性菌大肠杆菌、鳗弧球菌和嗜水气单胞菌结合,可以作为抗菌效应分子来直接杀死细菌。还对其体内活性进行了验证,将rZRANB2用显微注射技术注入斑马鱼早期胚胎可以显著提高胚胎对斑马鱼病原菌嗜水气单胞菌的抵抗能力,同时注入抗ZRANB2的抗体会让抵抗力明显地降低,而注入抗actin的抗体却没有此作用。最后,证明了Z1/37和Z11/37具有体外抗菌活性,将其注入胚胎也会提高胚胎对嗜水气单胞菌的抵抗力,但是多肽Z38/198却没有相应的抗菌活性。综上所述,本文阐明了ZRANB2是一个母源性LPS结合蛋白,可以通过结合和杀死细菌来保护斑马鱼早期胚胎抵御病原菌的侵袭,这是关于ZRANB2功能的一个新发现。本文为研究动物中普遍存在的锌指蛋白的免疫功能提供了新的视角。
【关键词】：斑马鱼 胚胎 ZRANB2 母源性 LPS结合蛋白
【学位授予单位】：中国海洋大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S917.4
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-13
• 第一章 文献综述13-33
• 1 斑马鱼简介13-15
• 2 鱼类的免疫系统15-23
• 2.1 免疫系统的个体发生15-16
• 2.2 淋巴器官16-17
• 2.2.1 胸腺16
• 2.2.2 肾脏16-17
• 2.2.3 脾17
• 2.3 参与免疫反应的细胞17
• 2.4 鱼类的非特异性免疫17-22
• 2.4.1 物理屏障17-18
• 2.4.2 非特异性细胞的细胞毒性18
• 2.4.3 抗菌肽18
• 2.4.4 吞噬作用18
• 2.4.5 补体18-19
• 2.4.6 肿瘤坏死因子(TNF)19
• 2.4.7 干扰素(INF)19-20
• 2.4.8 白介素(IL)20
• 2.4.9 其它的细胞因子和趋化因子20
• 2.4.10 蛋白激酶抑制剂20
• 2.4.11 溶菌酶20-21
• 2.4.12 天然抗体21
• 2.4.13 正五聚蛋白21
• 2.4.14 转铁蛋白21-22
• 2.5 鱼类的特异性免疫22-23
• 2.5.1 抗体22
• 2.5.2 免疫记忆22-23
• 2.5.3 细胞的细胞毒性23
• 2.5.4 适应性免疫中的细胞因子23
• 3 先天性免疫23-29
• 3.1 先天性免疫系统的非自我识别23-26
• 3.2 先天性免疫与疾病26-28
• 3.3 母源性免疫与鱼类28-29
• 4 高通量分离技术29-30
• 5 锌指蛋白研究概况30-31
• 5.1 锌指结构30-31
• 5.2 锌指蛋白31
• 6 ZRANB2的研究概况31-32
• 7 本文的研究目的和技术路线32-33
• 7.1 研究目的32
• 7.2 技术路线32-33
• 第二章 斑马鱼母源性免疫因子的高通量分离与鉴定33-95
• 1 前言33
• 2 材料和方法33-63
• 2.1 实验材料33-36
• 2.1.1 实验动物33
• 2.1.2 实验仪器33-34
• 2.1.3 实验试剂34-36
• 2.2 从斑马鱼胚胎提取液中高通量分离母源性免疫因子36-40
• 2.2.1 斑马鱼卵液的制备36-37
• 2.2.2 制备交联有LPS的琼脂糖凝胶柱37
• 2.2.3 上样与洗脱37-38
• 2.2.4 SDS-PAGE检测38-39
• 2.2.5 质谱鉴定39-40
• 2.3 Western blotting检测目的蛋白在不同组织和不同发育时期的存在情况40-41
• 2.3.1 斑马鱼各组织和不同发育时期匀浆液的获得40
• 2.3.2 Western blotting检测40-41
• 2.4 斑马鱼zranb2基因序列的获得41-47
• 2.4.1 斑马鱼胚胎总RNA提取41-42
• 2.4.2 斑马鱼胚胎总cDNA的获得42-45
• 2.4.3 斑马鱼zranb2基因的克隆45-47
• 2.5 斑马鱼zranb2的序列分析、进化分析和基因组织结构分析47-48
• 2.6 Real-time PCR技术检测斑马鱼zranb2的表达情况48-50
• 2.6.1 Real-time PCR所用实验材料的获得48
• 2.6.2 RNA的提取、cDNA模板的合成与检测48
• 2.6.3 设计Real-time PCR特异性引物48-49
• 2.6.4 Real-time PCR扩增49-50
• 2.7 原位杂交技术检测斑马鱼zranb2的表达情况50-53
• 2.7.1 合成探针50
• 2.7.2 原位杂交技术50-53
• 2.8 斑马鱼ZRANB2重组蛋白的体外表达53-57
• 2.8.1 斑马鱼ZRANB2体外表达载体的构建53-54
• 2.8.2 斑马鱼rZRANB2的体外表达54-55
• 2.8.3 斑马鱼rZRANB2的纯化55-56
• 2.8.4 斑马鱼rZRANB2的浓缩56-57
• 2.9 斑马鱼rZRANB2与LPS结合能力的鉴定57-58
• 2.9.1 用NHS-LC-biotin标记rZRANB2和BSA57
• 2.9.2 ELISA技术检测rZRANB2与LPS的结合情况57-58
• 2.9.3 ELISA技术检测rZRANB2与脂质A的结合情况58
• 2.9.4 ELISA技术检测rZRANB2与单糖的结合情况58
• 2.10 斑马鱼rZRANB2与细菌结合能力的鉴定58-59
• 2.10.1 大肠杆菌、鳗弧球菌和嗜水气单胞菌的培养58-59
• 2.10.2 Western bloting技术分析重组蛋白与细菌的结合情况59
• 2.10.3 用异硫氰酸荧光素(FITC)标记法分析rZRANB2与细菌的结合能力59
• 2.11 斑马鱼rZRANB2的抗菌活性的验证59-60
• 2.11.1 大肠杆菌、鳗弧球菌和嗜水气单胞菌的培养59
• 2.11.2 斑马鱼rZRANB2对大肠杆菌和鳗弧球菌的抗菌活性的验证59-60
• 2.11.3 斑马鱼rZRANB2对嗜水气单胞菌的抗菌活性的验证60
• 2.12 斑马鱼rZRANB2流式细胞术检测60-61
• 2.13 斑马鱼胚胎中ZRANB2的抗菌活性的验证61-62
• 2.13.1 检测斑马鱼胚胎提取液中ZRANB2的抗菌活性61
• 2.13.2 检测斑马鱼体内ZRANB2是否有胚胎防御作用61-62
• 2.14 斑马鱼胚胎中ZRANB2的浓度测定62
• 2.15 斑马鱼ZRANB2活性中心的探寻62-63
• 3 结果63-92
• 3.1 从斑马鱼胚胎提取液中高通量分离母源性免疫因子63-65
• 3.1.1 高通量分离斑马鱼母源性免疫因子的质谱结果63-64
• 3.1.2 Western blotting检测斑马鱼ZRANB2在不同组织中的分布情况64-65
• 3.1.3 Western blotting检测斑马鱼ZRANB2在不同时期胚胎中的表达情况65
• 3.2 斑马鱼zranb2基因的序列分析、结构分析、进化分析和共线性分析65-72
• 3.2.1 斑马鱼zranb2基因序列的获得65-66
• 3.2.2 斑马鱼zranb2基因的序列分析66-70
• 3.2.3 斑马鱼ZRANB2结构分析70-71
• 3.2.4 斑马鱼ZRANB2进化分析71
• 3.2.5 斑马鱼zranb2基因的共线性分析71-72
• 3.3 斑马鱼zranb2在不同组织和不同时期的表达模式72-78
• 3.3.1 qRT-PCR检测的斑马鱼zranb2在不同组织中的表达模式72-74
• 3.3.2 qRT-PCR检测的斑马鱼zranb2在不同时期的表达模式74-76
• 3.3.3 WISH检测的斑马鱼zranb2在不同组织中的表达模式76-78
• 3.4 斑马鱼rZRANB2的体外重组表达78-80
• 3.4.1 pET-28a/zranb2表达载体的构建78-79
• 3.4.2 斑马鱼rZRANB2的体外表达和纯化79-80
• 3.4.3 斑马鱼rZRANB2的Western blotting鉴定80
• 3.5 斑马鱼rZRANB2与LPS结合情况的验证80-81
• 3.6 斑马鱼rZRANB2与细菌结合情况的验证81-83
• 3.6.1 Western blotting检测结果81-82
• 3.6.2 FITC标记法的检测结果82-83
• 3.7 斑马鱼rZRANB2体外抗菌活性的验证83
• 3.8 斑马鱼rZRANB2流式细胞术检测83-84
• 3.9 斑马鱼早期胚胎中ZRANB2的免疫防护作用的验证84-87
• 3.9.1 斑马鱼早期胚胎提取液中ZRANB2抗菌活性的验证84-85
• 3.9.2 斑马鱼早期胚胎中ZRANB2抗菌活性的验证85-87
• 3.10 斑马鱼早期胚胎中ZRANB2浓度的确定87-89
• 3.11 斑马鱼ZRANB2截短后多肽的抗菌活性的验证89-92
• 3.11.1 斑马鱼ZRANB2截短示意图89
• 3.11.2 Z_(38/198)、Z_(1/37)和Z_(11/37)体外抗菌活性以及与LPS结合能力的验证89-92
• 3.11.3 Z_(38/198)、Z_(1/37)和Z_(11/37)体内抗菌活性的验证92
• 4 讨论92-95
• 总结与展望95-96
• 参考文献96-109
• 致谢109-110
• 个人简历110
• 发表的文章110

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 刘丽丽;王健;王海胜;余凯敏;李国超;闫艳春;;斑马鱼转基因平台的建立[J];生物技术通报;2013年10期

2 朱琳,史淑洁;斑马鱼胚胎发育技术在毒性评价中的应用[J];应用生态学报;2002年02期

3 孙桂金;潘杰;刘可春;王雪;王思锋;;斑马鱼不同发育时期血管内皮生长因子受体2基因表达的实时定量PCR分析[J];安徽农业科学;2010年16期

4 唐志扬;许楠;李振山;;单壁碳纳米管对斑马鱼生理生化特性的影响[J];生态与农村环境学报;2012年06期

5 周艳;徐建;冯艳红;赵欣;万金忠;林玉锁;;有机污染场地浅层地下水对斑马鱼胚胎发育的生物毒性研究[J];生态与农村环境学报;2012年06期

6 卜纪雯;马军;;斑马鱼重要基因对心脏发育关键环节的调控[J];安徽农业科学;2008年14期

7 逯娟;李凤超;穆淑梅;康现江;王殿贺;;莠去津对斑马鱼胚胎发育及幼鱼成活的影响[J];安徽农业科学;2009年02期

8 刘在平;张松林;;城市污水对斑马鱼胚胎的影响[J];生态环境学报;2010年12期

9 陈宝增;李凤超;康现江;;实验室斑马鱼的繁育与养殖技术[J];河北渔业;2008年04期

10 李俊霞;;葡萄糖溶液对斑马鱼胚胎发育的影响[J];安徽农业科学;2009年19期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 马雯雯;杭晓明;王巍;刘聪;孙野青;;模拟微重力影响斑马鱼胚胎发育的蛋白质组特征[A];“基因、进化与生理功能多样性”海内外学术研讨会暨中国生理学会第七届比较生理学学术会议论文摘要[C];2009年

2 张利军;史慧勤;彭双清;;基于斑马鱼模式动物的阿霉素心脏毒性作用研究[A];2010年全国药物毒理学学术会议论文集[C];2010年

3 王晗;;斑马鱼生物钟调节的分子遗传和基因组机制[A];2011年全国时间生物医学学术会议论文集[C];2011年

4 林秀坤;;斑马鱼作为抗肿瘤药物模型的分子基础[A];第四届中国肿瘤大会中国药理学会肿瘤药理专业委员会分会场学术会议论文摘要[C];2006年

5 侯佳;桂永浩;张立凤;王跃祥;宋后燕;钟涛;;视黄酸缺乏对斑马鱼胚胎心脏发育的影响[A];中华医学会第五次全国儿科中青年学术交流大会论文汇编（上册）[C];2008年

6 陈锡强;韩利文;王希敏;王思锋;侯海荣;刘可春;;促渗剂氮酮对斑马鱼胚胎的透皮作用及其毒性影响(英文)[A];2012年中国药学大会暨第十二届中国药师周论文集[C];2012年

7 于永利;杨景峰;王思珍;董武;;高残留农药福美双对斑马鱼胚胎体节以及脊索的影响[A];持久性有机污染物论坛2010暨第五届持久性有机污染物全国学术研讨会论文集[C];2010年

8 巴雅斯胡;杨景峰;于永利;王思珍;董武;;高残留农药代森锌诱导斑马鱼胚胎脊索变形[A];持久性有机污染物论坛2011暨第六届持久性有机污染物全国学术研讨会论文集[C];2011年

9 张利军;郭家彬;苑晓燕;史慧勤;赵君;束玉磊;彭双清;;应用斑马鱼胚胎和幼鱼评价布洛芬的心脏毒性[A];2013年（第三届）中国药物毒理学年会暨药物非临床安全性评价研究论坛论文摘要[C];2013年

10 朱小山;朱琳;李燕;端正花;;富勒烯(C_(60))对斑马鱼胚胎发育毒性的初步研究[A];第三届全国环境化学学术大会论文集[C];2005年

中国重要报纸全文数据库 前8条

1 刘妍;美国培育出终生透明的斑马鱼[N];中国渔业报;2008年

2 本报记者 滕继濮;小小斑马鱼 大大有用处[N];科技日报;2010年

3 枫叶　编译;筛选药物：斑马鱼责任重大[N];医药经济报;2012年

4 记者 熊琳晖 通讯员 孙慧;研究斑马鱼揭示器官再生之谜[N];长江日报;2013年

5 罗刚 李兵;斑马鱼破译人类基因的先锋[N];健康报;2004年

6 记者 李学梅;斑马鱼为治疗白血病提新思路[N];新华每日电讯;2010年

7 本报记者 许琦敏;静候那一点流星似的光亮[N];文汇报;2012年

8 本报记者 许琦敏;刘廷析 “掘宝”斑马鱼世界[N];文汇报;2011年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 管翊闳;核仁因子Def磷酸化修饰调控细胞周期和p53降解的研究[D];浙江大学;2015年

2 胡晶莹;环境雌激素影响斑马鱼生殖系统发育机制的初步研究[D];复旦大学;2011年

3 赵婷;Karsch-Neugebauer综合征斑马鱼模型的建立和行为学观察[D];复旦大学;2014年

4 王健;新型斑马鱼模型在研究肿瘤浸润、转移和血管侵袭机制中的应用[D];山东大学;2015年

5 王明勇;斑马鱼生物钟基因per2突变体的构建及在生物钟系统中的功能分析[D];苏州大学;2014年

6 龚璐;p53及其异构体△133p53/△113p53在人类细胞和斑马鱼中的功能及生物学意义研究[D];浙江大学;2015年

7 郭翠翠;斑马鱼D3b基因结构及其在胚胎发育中的作用研究[D];上海交通大学;2014年

8 沈兵;致癌染料的生理毒性及分子机制研究[D];浙江大学;2015年

9 张庆友;斑马鱼Mil/s1pr2和vmhc基因的功能研究及药源性心脏毒性模型的建立[D];北京协和医学院;2011年

10 杨梅;乙草胺对斑马鱼的发育和生殖内分泌干扰机制研究[D];浙江大学;2015年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 崔俊安;稀土对斑马鱼胚胎发育的影响[D];青岛科技大学;2011年

2 吴二社;nano-TiO_2,nano-Ag对斑马鱼胚胎发育的毒理学研究[D];西北师范大学;2012年

3 温鼎声;利用模式生物斑马鱼对化合物心脏毒性和急毒性筛选的研究[D];华南理工大学;2012年

4 梁荣朝;丙烯酰胺对斑马鱼生物余能的影响及对其肝、鳃毒性的作用[D];哈尔滨商业大学;2013年

5 海洋;鱼藤素对斑马鱼胚胎CyclinD1的表达调控及相关抗肿瘤机制研究[D];华南理工大学;2015年

6 蒋宇霞;东江流域沉积物生物毒性及其沉积物质量综合评价[D];中国科学院研究生院(广州地球化学研究所);2015年

7 袁忠月;壳聚糖纳米载体对神经系统影响的研究[D];浙江大学;2015年

8 余凯敏;毒死蜱对斑马鱼胚胎的毒性机制研究[D];中国农业科学院;2015年

9 罗茜;斑马鱼生长抑素-1基因靶向敲降和营救以及基于表达谱的胚胎发育功能分析[D];西南大学;2015年

10 胡月阳;UBE2C基因在斑马鱼胚胎发育中的时空表达规律[D];河北医科大学;2015年

，

本文编号：803984