鸭RIG-I在免疫调节中的作用及分子调控机制

发布时间：2017-09-27 01:16

  本文关键词：鸭RIG-I在免疫调节中的作用及分子调控机制

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【摘要】：近年来,禽流感特别是高致病性禽流感给养禽业带来毁灭性的打击,并引发一系列的公共卫生安全问题。鸡、鸭同为家禽,对流感病毒有着不同的敏感性,这与宿主本身抗性基因和免疫相关基因的表达调控存在着密切的关系。维甲酸诱导基因I (Retinoic acid inducible gene Ⅰ, RIG-I)能识别流感病毒并触发先天性免疫,该基因在鸡基因组上缺失,鸭基因组中保留,这种缺失使得鸡与其他禽类相比对禽流感病毒更易感、临床症状更明显。但到目前为止,鸭RIG-I是如何发挥抗病毒作用尚不清楚。本实验尝试从不同角度阐释鸭RIG-I在免疫调节中的作用及分子调控机制,旨在揭示duRIG-I在抗病毒先天性免疫信号传递途径及其代偿机制,并以期进一步完善鸡体内抗病毒先天性免疫途径及禽类免疫系统相关的基础研究。主要研究内容如下：1.为探讨duRIG-I基因的功能,首先克隆获得了duRIG-I cDNA序列,提交GenBank(登录号为JQ946323.2和KC869660.1),发现了3'UTR存在可变剪接体；间接免疫荧光方法检测结果显示duRIG-I蛋白主要位于细胞质,其次位于细胞核,进一步证实了该蛋白为胞质受体；半定量RT-PCR检测结果显示duRIG-I在心、肝、肾、腺胃、大肠、小肠、肌肉、胸腺和下丘脑等组织的本底表达均处于较低水平,仅在脾脏和肺脏组织中有少量表达；进一步采用poly[I:C]模拟病毒感染,实时定量PCR检测感染96h内的脾脏和肝脏中的duRIG-I基因的mRNA动态表达变化,发现感染8h后脾脏和肝脏中duRIG-I基因表达量均显著上升(P0.05)。2.基于上述duRIG-I基因呈诱导性表达的特点,我们开展了duRIG-I表达调控研究。首先克隆了duRIG-I启动子区,在线预测发现该基因启动子区存在一个明显的CpG岛,但BSP进一步检测结果显示,脾脏等中RIG-I启动子区的CpG岛处于非甲基化状态。双荧光素酶报告基因系统检测duRIG-I基因启动子转录活性结果显示,在+14～-301 bp存在正调控,该区的转录因子结合位点预测结果表明,IRF1等反式作用因子可能起着重要作用。3.为了证实duRIG-I的激活机制,对duRIG-I进行保守结构域预测,发现duRIG-I基因具有RLRs家族的典型特征(包括CARD结构域、RNA解旋酶等功能结构域),据此构建了不同结构域缺失突变体的表达载体,经RT-PCR,间接免疫荧光和Western blot方法鉴定重组质粒的表达,利用RT-qPCR检测结果发现CARD结构域能介导RLR通路上IFN-β、Mx1及PKR基因的表达显著上调；进一步采用NF-κB荧光素酶报告系统和ELISA检测poly[I:C]介导的IFN-β的表达量,结果发现经poly[I:C]诱导,duRIG-Ⅰ被显著激活,同时CARDs结构域能够通过激活NF-κB促使IFN-β的产生。4.为进一步探索duRIG-I基因在抗病毒先天性免疫中的作用,慢病毒介导的duRIG-I基因在DF-1细胞中持续稳定高表达,获得了稳转细胞株DF-1/LV5-RIG-I和DF-1/LV5,并用RT-PCR及Western Blot验证duRIG-I基因mRNA水平和蛋白水平的表达情况,为下一步研究提供了细胞模型。5.为探索duRIG-I在抗病毒先天性免疫信号传递途径及其代偿机制,我们利用5'ppp-dsRNA模拟病毒感染,进行RNA-seq,共筛选出278个差异基因(duRIG-I基因介导的应答基因),其中120个差异基因被注释到KEGG数据库中,富集分析最可靠的通路为RIG-I样受体信号通路；GO二级功能的富集分析主要富集在Ⅰ型干扰素信号通路、T细胞介导的细胞毒性正向调控、β干扰素的细胞应答、RIG-I信号通路的正向调控等条目；通过Cytoscape软件,基于通路上共有的差异基因,构建了RIG-I信号通路与其他信号通路交联的关系网路图,推测Jak-STAT信号通路、Toll样受体信号通路、细胞因子-细胞因子受体关联、Wnt信号通路、泛素介导的蛋白水解作用、MAPK信号通路等在抗病毒信号转导过程中可能与RIG-I介导的通路存在分子交联；经进一步筛选得到RIG-I介导信号通路关键应答基因,如ISG12-2、OSA*A、Mx1、IFIT5、TRIM25、USP18、STAT1、STAT2、IRF1、 IRF3、IRF8等,Real-time PCR验证差异基因表达趋势与测序结果相一致,并结合已有文献报道,提出了鸡中的RIG-I基因介导的信号转导的假设图。
【关键词】：鸭 RIG-I 表达调控 信号通路
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.2
【目录】：

• 中文摘要3-5
• ABSTRACT5-11
• 符号说明11-12
• 第一章 文献综述12-24
• 1 先天性免疫概述12-14
• 1.1 先天性免疫12-13
• 1.2 模式识别受体13-14
• 2 RIG-I研究进展14-22
• 2.1 RIG-I的分子结构14-15
• 2.2 RIG-I的激活机制15
• 2.3 RIG-I识别的配体15-19
• 2.4 RIG-I诱导Ⅰ型干扰素中的作用19
• 2.5 RIG-I介导的信号转导调控19-20
• 2.6 病毒干扰RIG-I介导的信号转导20-22
• 3 RIG-I在家禽上的研究进展22
• 4 研究的目的和意义22-24
• 第二章 鸭RIG-I基因克隆、表达及结构域功能的初步分析24-52
• 1 材料和方法24-31
• 1.1 实验材料24-25
• 1.1.1 实验动物24
• 1.1.2 实验试剂24-25
• 1.2 实验方法25-31
• 1.2.1 总RNA提取及cDNA合成25
• 1.2.2 基因全长获取25-27
• 1.2.3 生物信息学分析27-28
• 1.2.4 启动子系列缺失表达载体的构建28
• 1.2.5 结构域缺失突变体的构建28-29
• 1.2.6 细胞培养与瞬时转染29
• 1.2.7 间接免疫荧光29
• 1.2.8 荧光定量PCR分析29-30
• 1.2.9 Western blot30
• 1.2.10 双荧光素酶报告基因实验30
• 1.2.11 BSP实验(亚硫酸盐测序)30-31
• 1.2.12 数据处理与分析31
• 2 结果与分析31-49
• 2.1 鸭RIG-I基因克隆与序列分析31-36
• 2.1.1 鸭RIG-I基因克隆31-32
• 2.1.2 鸭RIG-I基因序列分析与分子进化分析32-36
• 2.2 鸭RIG-I基因表达规律分析36-38
• 2.2.1 鸭RIG-I基因亚细胞定位36-37
• 2.2.2 鸭RIG-I基因不同组织表达规律分析37
• 2.2.3 poly[I：C]模拟病毒感染对鸭RIG-I基因表达的影响37-38
• 2.3 鸭RIG-I基因启动子克隆及甲基化分析38-42
• 2.3.1 鸭RIG-I基因启动子区克隆及序列分析38-39
• 2.3.2 鸭RIG-I基因启动子转录活性的检测39-40
• 2.3.3 鸭RIG-I基因甲基化分析40-42
• 2.4 鸭RIG-I基因结构域功能的初步分析42-49
• 2.4.1 鸭RIG-I全长及不同结构域的缺失突变体的构建及鉴定42-47
• 2.4.2 鸭RIG-I不同结构域对RLR信号通路诱导激活作用47-48
• 2.4.3 poly[I：C]诱导下,不同结构域的表达对IFN-p表达的影响48-49
• 3 讨论49-52
• 第三章 RIG-I介导的抗病毒信号通路调控机制研究52-80
• 1 材料与方法52-58
• 1.1 实验材料52-53
• 1.1.1 慢病毒法建立稳转细胞株相关材料52
• 1.1.2 转录组实验相关材料52-53
• 1.2 实验方法53-58
• 1.2.1 慢病毒法建立过表达duRIG-I-His的DF-1细胞株53-54
• 1.2.2 5'ppp-dsRNA模拟病毒感染实验54
• 1.2.3 RNA-Seq样品制备及测序54-55
• 1.2.4 RNA-Seq测序数据处理及生物信息学分析55-56
• 1.2.5 RNA-Seq测序数据差异基因荧光定量PCR验证56-58
• 2 结果与分析58-77
• 2.1 慢病毒转染技术实现duRIG-I基因在DF-1细胞中持续稳定高表达58-63
• 2.1.1 DF-1细胞慢病毒感染效率评价58-59
• 2.1.2 Puromycin致死浓度筛选59-60
• 2.1.3 DF-1靶细胞感染与稳转实验60-63
• 2.1.4 Real-time PCR及western blot检测稳转细胞株63
• 2.2 RNA提取及质量检测63-64
• 2.3 RNA-Seq产量统计与评估64-65
• 2.3.1 测序数据统计与评估64-65
• 2.3.2 RNA-Seq整体质量评估65
• 2.4 基因表达水平分析65-68
• 2.4.1 基因表达定量65
• 2.4.2 RIG-I基因的定量分析65-67
• 2.4.3 样品重复性检验67-68
• 2.5 RIG-I介导的抗病毒信号通路相关基因表达分析68-74
• 2.5.1 差异表达基因筛选68-69
• 2.5.2 差异表达基因相关信号通路的富集69-71
• 2.5.3 差异表达基因网络关系71-74
• 2.6 差异表达基因的实时荧光定量PCR验证74-77
• 2.7 RIG-I基因介导的信号转导的假设图构建77
• 3 讨论77-80
• 3.1 稳转鸭RIG-I蛋白DF-1细胞系的建立77-78
• 3.2 抗病毒信号通路的crosstalk78-79
• 3.3 鸭RIG-I介导的抗病毒信号通路中泛素分子的响应79
• 3.4 鸭RIG-I介导的抗病毒信号通路应答基因79-80
• 全文结论80-81
• 主要创新点81
• 进一步研究设想81-82
• 参考文献82-93
• 附录93-100
• 致谢100-101
• 攻读学位期间发表的学术论文目录101-103

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