西藏野生大麦耐旱特异蛋白与相关基因鉴定及外源甜菜碱缓解大麦干旱胁迫生理机理的研究

发布时间：2017-09-27 17:20

  本文关键词：西藏野生大麦耐旱特异蛋白与相关基因鉴定及外源甜菜碱缓解大麦干旱胁迫生理机理的研究

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【摘要】：干旱是全球范围内限制作物产量最主要的气象灾害。培育抗旱作物品种是提高干旱胁迫下作物产量经济有效的途径；发掘特异抗/耐旱种质,明确其耐性机制是培育耐旱新品种和制定耐旱调控措施的基础。青藏高原一年生野生大麦(以下简称西藏野生大麦)蕴藏着多种抗逆特异基因,为大麦遗传改良提供了有效的基因库。本研究以本实验室前期筛选获得的耐旱性不同的西藏野生大麦基因型(Hordeum vulgare subsp. spontaneum)为材料,比较分析干旱胁迫下蛋白质表达谱的基因型差异,鉴定野生大麦耐旱相关的目标蛋白,克隆耐旱相关基因,从分子水平上探讨野生大麦耐旱机制。同时,探讨了外源甜菜碱对干旱胁迫下大麦的缓解效应及生理机制,为作物耐旱育种与生产提供理论依据和技术指导。主要研究结果如下： 1.干旱胁迫对西藏野生大麦蛋白表达谱的影响及基因型差异 以耐旱西藏野生大麦基因型XZ5及干旱敏感基因型XZ54为材料,以栽培品种浙农大3号为对照,盆栽干旱胁迫试验,设两个处理：对照,在整个过程中正常浇水,保持土壤含水量30-40%；干旱胁迫,2叶期开始停止浇水20d至土壤含水量下降到4%,复水并保持正常水分供应5d。干旱胁迫后分别在土壤含水量达10%(SMC10)、4%(SMC4)及复水后2d(R1)和5d(R2)时取植株叶片,利用双向电泳和MALDI-TOF质谱技术,分析比较干旱胁迫前后的蛋白质表达谱及其基因型差异,分离鉴定耐旱相关特异蛋白。结果表明,双向电泳技术每张胶成功分离到1700多个蛋白点,鉴定到基因型差异表达的与XZ5耐旱相关的蛋白点38个,质谱鉴定和生物信息分析结果显示,上述XZ5耐旱相关的蛋白分别属于光合作用、逆境胁迫反应、新陈代谢、能量和氨基酸生物合成,包括1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶大亚基(rbcL, Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit)和m型硫氧化还原蛋白(Trx-M, Thioredoxin M, chloroplast precursor)。其中,6个蛋白点在XZ5特异上调表达,包括黑色素瘤相关抗原p7(melanoma-associated antigen p97)、I型叶绿素a/b结合蛋白b (type Ⅰ chlorophyll a/b-binding protein b)、谷胱甘肽S-转移酶1(glutathione S-transferase1)和二磷酸核酮糖羧化酶大亚基(ribulosebisphosphate carboxylase large chain),其中的I型叶绿素a/b结合蛋白b仅在XZ5中特异表达(XZ54和浙农大3号中均没有检测到这个蛋白点)。说明这些蛋白可能与耐旱基因型XZ5耐旱性紧密相关。 2.西藏野生大麦不同基因型rbcL与Trx-M干旱响应基因CDS克隆及序列分析 利用简并PCR技术从XZ5、XZ54及浙农大3号大麦基因型叶片中分离rbcL和Trx-M基因编码区序列,分别为1401bp(部分CDS区序列)和528bp(全部CDS区序列)两个基因分别编码467和176个氨基酸,均无内含子。且该基因核苷酸序列及其推导出的氨基酸序列与小麦、水稻、玉米、甘蔗及大豆等植物具有较高的同源性。经序列比对分析,发现rbcL基因核苷酸序列在XZ5和XZ54中存在差异,在编码区序列存在5个SNPs (single nucleotide polymorphism),其中的2个SNPs为错义突变。另外,Trx-M基因核苷酸序列在XZ5、 XZ54和浙农大3号中存在差异,在保守结构域中有3个SNPs,均为错义突变,说明这些错义突变导致蛋白质结构的差异,从而可能影响其功能。采用ExPASy数据库工具分析rbcL和Trx-M基因的理化特性,结果表明这两个基因所编码的氨基酸序列的蛋白分子量分别为5.17和1.92KDa,等电点分别为6.44和8.57。经SignalP软件预测出这两个基因均不含信号肽,为非分泌型蛋白。利用NCBI-BLASTP检索大麦rbcL和Trχ-M基因编码氨基酸序列同源的物种,并通过ClustalX软件对其进行多重序列比对,发现两个基因其进化过程中有较强的保守性。进一步通过ANTHEPROT软件完整预测出rbcL和Trx-M的二级结构：rbcL二级结构为α螺旋、β折叠、转角、卷曲分别占37%、19%、24%、20%；Trx-M二级结构为α螺旋、β折叠、转角、卷曲分别占31%、29%、26%、14%。通过在线Phyre2预测出rbcL和Trx-M的三级结构。此外,SMART (http://smart. embl-heidelberg.de/)在线预测软件对rbcL和Trx-M的蛋白质功能结构域进行分析,发现rbcL蛋白含两个保守结构域；21～146bp大麦不同基因型XZ5、 XZ54和浙农大3号)区间为RuBisco large N结构域；154-462bp (XZ5),154～433(XZ54)和154-462(浙农大3号)区间为RuBisco large结构域。推测其功能是在RuBisco羧化酶的活性及对镁离子绑定方面发挥作用。其中69-172(大麦不同基因型XZ5、 XZ54和浙农大3号)区间为Trx-M结构域。 3.外源甜菜碱对大麦干旱胁迫的缓解效应 以大麦品种浙大9号为材料,水培20%PEG6000模拟干旱胁迫试验,设4个处理：对照(基本培养液BNS)、 Betaine (BNS+(?)十片喷施5OOμM Betaine)、 Drought (BNS+20%PEG6000)、 Drought+Betaine (BNS+叶片喷施5OOμM Betaine+20%PEG6000),研究外源甜菜碱对干旱所致大麦损伤的缓解作用。结果表明,20%PEG6000模拟干旱肋迫环境下,叶面喷施甜菜碱(Drought+Betaine)能显著缓解干旱对大麦幼苗的损害,株高、根长及生物量都比单独PEG干旱胁迫有显著提高。外源甜菜碱显著影响细胞超微结构及活性氧代谢,显著缓解干旱胁迫引起的叶绿体和根系细胞结构的损害,有效保护根系分生组织细胞核膜的完整性。叶片喷施甜菜碱对干旱胁迫引起大麦氧化损伤有明显的缓解效应,显著提高叶片/根系SOD、 CAT、 APX (分别比单独PEG-高15.5%/19.8%；13.50%/7.9%;10.0%/31.9%：10.45%/11.3%)抗氧化酶活性。此外,甜菜碱增强干旱胁迫下大麦的光合速率,有效缓解干旱胁迫引起的光合作用抑制作用。
【关键词】：干旱胁迫 大麦(Hordeum vulgare L.) 蛋白质组学 西藏野生大麦 质谱分析技术 基因克隆 甜菜碱 活性氧代谢 特异蛋白 超微结构
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S512.3
【目录】：

• 致谢6-7
• 摘要7-9
• ABSTRACT9-12
• 目录12-14
• 第一章 文献综述14-30
• 1.1 植物响应干旱胁迫的生理机制14-17
• 1.1.1 干旱胁迫对植物形态结构的影响14
• 1.1.2 干旱胁迫对植物光合特性的影响14-15
• 1.1.3 干旱胁迫对植物活性氧代谢的影响15-16
• 1.1.4 干旱胁迫对植物渗透调节的影响16-17
• 1.2 植物蛋白质组学研究进展17-26
• 1.2.1 蛋白质组学研究技术与方法18-22
• 1.2.2 植物响应非生物胁迫比较蛋白组学研究进展22-26
• 1.3 作物耐旱种质鉴定与评价研究进展26-27
• 1.3.1 耐早鉴定方法26-27
• 1.3.2 耐旱鉴定的评价指标27
• 1.4 外源甜菜碱缓解干旱胁迫研究进展27-28
• 1.5 本研究立题依据28-30
• 第二章 干旱胁迫对西藏野生大麦蛋白表达谱的影响及基因型差异30-55
• 2.1 材料与方法30-34
• 2.1.1 试验设计30-31
• 2.1.2 蛋白质样品制备31
• 2.1.3 蛋白质双向凝胶电泳31-33
• 2.1.4 实时定量PCR验证部分差异表达基因33-34
• 2.2 结果与分析34-50
• 2.2.1 干旱胁迫和对照条件下不同大麦基因型叶片蛋白质表达分析34-42
• 2.2.2 干旱胁迫下差异表达蛋白点的基因型间比对及质谱鉴定42-45
• 2.2.3 干旱胁迫响应蛋白的功能分类45-48
• 2.2.4 干旱胁迫下部分差异表达蛋白的qRT-PCR验证48-50
• 2.3 讨论50-55
• 第三章 西藏野生大麦耐旱相关基因rbcL与Trx-M的克隆及序列分析55-66
• 3.1 材料与方法55-58
• 3.1.1 试验材料55
• 3.1.2 分子生物学载体与试剂55
• 3.1.3 总RNA提取55-56
• 3.1.4 cDNA第一链合成56
• 3.1.5 基因CDS获得56-58
• 3.1.6 编码蛋白的结构分析58
• 3.2 结果与分析58-64
• 3.2.1 XZ5、XZ54及农大3号rbcL和Trx-M基因CDS的克隆58-60
• 3.2.2 rbcL和Trx-M核苷酸与氨基酸组成差异分析60-62
• 3.2.3 rbcL和Trx-M基因序列同源性分析62-64
• 3.3 讨论64-66
• 第四章 外源甜菜碱对大麦干旱胁迫的缓解效应66-77
• 4.1 材料与方法66-68
• 4.1.1 幼苗培养与试验处理66-67
• 4.1.2 分析测定方法67-68
• 4.1.3 数据处理68
• 4.2 结果与分析68-75
• 4.2.1 外源甜菜碱对干旱胁迫下大麦幼苗生长的影响68-69
• 4.2.2 外源甜菜碱对干旱胁迫下大麦幼苗Na、K含量的影响69-70
• 4.2.3 外源甜菜碱对干旱胁迫下大麦幼苗抗氧化酶活性的影响70-71
• 4.2.4 外源甜菜碱对干旱胁迫下大麦光合参数影响71-72
• 4.2.5 外源甜菜碱对干旱胁迫下大麦根尖细胞活力的影响72-73
• 4.2.6 外源甜菜碱对干旱胁迫下大麦细胞超微结构的影响73-75
• 4.3 讨论75-77
• 第五章 全文总结与展望77-79
• 5.1 全文总结77-78
• 5.2 研究展望78-79
• 参考文献79-92
• 缩略词表92-93
• 附录一：表目录93-94
• 附录二：图目录94-96
• 博士期间发表或已投稿的文章96

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前5条

1 李红兵;康振生;;适于小麦叶片蛋白质组分析的样品提取方法研究[J];西北植物学报;2011年03期

2 刘琴;孙辉;何道文;;干旱和高温对植物胁迫效应的研究进展[J];西华师范大学学报(自然科学版);2005年04期

3 王宝山;赵思齐;;干旱对小麦幼苗膜脂过氧化及保护酶的影响[J];山东师大学报(自然科学版);1987年01期

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5 韩瑞宏;卢欣石;高桂娟;杨秀娟;;紫花苜蓿(Medicago sativa)对干旱胁迫的光合生理响应[J];生态学报;2007年12期

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本文编号：930946