程序性细胞死亡与沉香倍半萜次生代谢关系的探索研究

发布时间：2017-10-02 00:04

  本文关键词：程序性细胞死亡与沉香倍半萜次生代谢关系的探索研究

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【摘要】：国产沉香为瑞香科白木香Aquilaria sinensis (Lour.) Gilg含树脂的木材,为著名的芳香南药,同时在香料、化工、宗教、工艺品等有广泛应用。白木香野生资源主要分布于海南、广东、广西、云南、福建等地。因伐树结香,目前白木香的野生资源几乎破坏殆尽,1999年被列为国家二级保护植物,2000年被列入《世界自然保护联盟受威胁植物红色名录》,2004年已被列入《濒危野生动植物种国际贸易公约》(CITES)附录Ⅱ。目前中国已种植的白木香林超过3000万株,迫切需要高效的结香技术。近年来,魏建和团队发明的“通体结香”技术已开始在国内外广泛应用,并获得了较好的结香效果。伤害诱导白木香防御反应形成沉香的机制已得到初步揭示,但沉香形成的机制,特别是初始伤害后沉香持续形成的分子机制尚未清晰阐明,制约了通体结香技术的改进及更优方法的发明。本论文首次较系统地研究了程序性细胞死亡(PCD, programmed cell death)与沉香倍半萜形成的关系,以探索PCD与沉香形成,特别是持续结香的关系。1、构建了体系均二稳定、细胞活力良好的白木香悬浮细胞体系,健康体系未检测到倍半萜a-愈创木烯(α-guaiene)、α-蛇麻烯(α-humulene和δ-愈创木烯(δ-guaiene),但MeJA可诱导其产生倍半萜,表明悬浮细胞体系可作为结香机制研究的离体材料。采用茎尖诱导愈伤组织,最适培养基为MS+2.0 mg-L·1 NAA+1.0 mg-L·16-BA;经12次继代培养的愈伤组织生长旺盛、质地疏松适于悬浮培养;将其置于液体培养基MS+2.0 mg·L~(-1) NAA+1.0 mg·L~(-1) 6-BA+500.0 mg·L~(-1) CH中震荡培养,建成悬浮细胞体系。悬浮细胞生长曲线呈S型,初期增长缓慢,4-6 d为对数增长期,7~(-1)2 d进入平台期,12d以后细胞生长速度及活力下降；GC-MS分析结果显示,培养0d、3d、6d、2d悬浮细胞未检测到倍半萜α-guaiene、α-humulene、 δ-guaiene,使用100μMMeJA处理24 h可明显检测到这三种倍半萜。PCD检测结果表明,悬浮细胞培养到24 d后发生PCD；荧光定量PCR检测倍半萜诱导结果表明,悬浮培养到24 d后倍半萜合成相关基因表达明显提高,说明生长后期的悬浮细胞不可用于结香机制研究。因此,本实验所构建的白木香悬浮细胞体系在7~(-1)2 d可作为研究伤害诱导白木香防御反应形成沉香机制的离体材料。2、首次克隆了沉香倍半萜合成途径的AsAACT、AsHMGS、AsHD及 AsDXR 4个基因全长,为检测倍半萜合成提供参考指标。本课题对沉香倍半萜合成的4个关键酶基因AsAACT、AsHMGS、AsDXR、AsHDR进行全长克隆、生物信息学分析。运用荧光定量PCR对茉莉酸甲酯MeJA及水杨酸SA诱导白木香悬浮细胞的关键基因AsAACT、AsHMGS、AsHMGR、AsDXS、AsDXR、AsHDR、AsFPS、ASS1、及ASS2表达进行分析,运用基因表达谱对火烙法、接菌法与输液法处理的白木香转录组数据进行分析,最终筛选到AsAACT、AsFPS、ASS1、ASS2为特异表达基因,可作为后续实验检测诱导型倍半萜的参考指标。3、H2O2胁迫可以明显诱导白木香悬浮细胞PCD,生成少量的α-guaiene、 α-humulene、δ-guaiene。H2O2处理后3h发生PCD,6~(-1)2 h出现明显的细胞核皱缩及DNA降解,24 hMCP1、MCP2、Cyt-c表达明显调高,48 h细胞核变为核小体；采用GC-MS检测、峰面积归一化法计算,得出三种倍半萜的相对百分含量,H_20_2处理后3h仅检测到0.058% α-humulene,6hFPS、ASS1、ASS2表达明显上调,12h可检测到0.244% α-humulene 与 0.521% δ-guaiene,24 h可检测到0.157% α-guaiene、 0.373% α-humulene、1.297%δ-guaiene。4、MeJA也可以明显诱导白木香悬浮细胞发生PCD,生成较大量的α-guaiene、 α-humulene、δ-guaiene。(1)采用2.5 μM～25 μM MeJA处理悬浮细胞,96h内细胞死亡率无明显变化,但采用TUNEL法可检测到阳性细胞,说明悬浮细胞发生了PCD但尚未死亡；MeJA处理后12 h,三种倍半萜总量最高,2.5μM和25μM MeJA处理分别达86.098%、71.825%,之后倍半萜量下降,48 h分别下降到31.993%、20.908%；(2)采用50μM～100μMMeJA处理,12h～96h细胞死亡率显著升高,TUNEL检测处理后悬浮细胞3h～6h呈弱阳性、24 h～96h呈阳性；三种倍半萜总量在12h～24 h最高,50μM和100μM MeJA处理分别达93.884%、89.037%,之后总量一直保持在71%以上；(3)采用250μM～500μM MeJA处理,在12h～96 h细胞死亡率显著升高,TUNEL检测处理后悬浮细胞3h呈弱阳性、96h呈阳性；三种倍半萜总量在24 h最高,250μM和500μM MeJA处理分别达90.197%、76.335%,之后总量一直保持在58%以上；(4)相关性分析表明,细胞死亡率与倍半萜浓度呈显著正相关,说明MeJA处理后悬浮细胞发生的PCD很可能由倍半萜诱导；(5)Caspase抑制剂Z-VAD-FMK可一定程度减缓悬浮细胞发生PCD的进程,但不能阻止,对倍半萜合成关键基因有下调趋势,反向证明PCD对倍半萜具有正向促进作用。5、愈创木烯型倍半萜guaiene及α-humulene能诱导白木香悬浮细胞的PCD,说明初始伤害后诱导白木香悬浮细胞生成的倍半萜可能会产生类似二次伤害的作用,进二步推动PCD的发生。guaiene、α-humulene处理健康的白木香悬浮细胞,可检测到PCD, guaiene比α-humulene更容易诱导PCD；随着倍半萜浓度增加、处理时间延长,细胞死亡率升高,TUNEL的荧光强度增大、PCD关键基因的表达上调。本研究采用白木香悬浮细胞体系探索了程序性细胞死亡与沉香倍半萜的关系。通过研究初步阐明伤害胁迫H202及MeJA可以诱导白木香悬浮细胞PCD与沉香倍半萜合成,诱导的倍半萜类成分guaiene、α-humulene能进一步推动PCD的发生。离体研究结果为揭示白木香受到伤害后诱导形成沉香的机制,特别是沉香持续形成的机制提供了新的数据。
【关键词】：白木香 倍半萜 沉香 程序性细胞死亡 结香机制
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S567.19
【目录】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-12
• 文献综述12-38
• 一、沉香结香机制的研究概况12-14
• 二、植物萜类次生代谢调控的研究进展14-22
• 三、胁迫诱导植物程序性细胞死亡的研究进展22-26
• References26-38
• 前言38-41
• References39-41
• 论文研究内容框架41-42
• 第一章 沉香木分层中的细胞存活状态及倍半萜分布42-52
• References47-52
• 第二章 白木香悬浮细胞体系的构建52-70
• 一、白木香悬浮细胞体系的构建及其可应用性评价52-60
• 二、生长后期白木香悬浮细胞PCD发生与倍半萜合成研究60-68
• References68-70
• 第三章 白木香倍半萜合成途径中四个关键酶基因AsAACT、AsHMGS、AsDXR、AsHDR的克隆及表达70-96
• 一、白木香倍半萜合成途径中四个关键基因AsAACT、AsHMGS、AsDXR、AsHDR的克隆与分析70-88
• 二、白木香倍半萜合成AsAACT、AsHMGS、AsDXR、AsHDR及其它5个关键基因的表达分析88-93
• References93-96
• 第四章 H_2O_2胁迫下白木香悬浮细胞PCD与倍半萜合成关系的研究96-104
• References102-104
• 第五章 MeJA诱导下白木香悬浮细胞PCD与倍半萜合成关系的研究104-122
• 一、MeJA诱导下白木香悬浮细胞PCD与倍半萜生成的关系104-116
• 三、Caspase抑制剂初探白木香悬浮细胞PCD与倍半萜的关系116-120
• References120-122
• 第六章 倍半萜诱导白木香悬浮细胞PCD的研究122-128
• References127-128
• 结语128-130
• 致谢130-132
• 作者情况介绍13

【参考文献】

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本文编号：956390