用RNA-seq技术鉴定Bt蛋白对拟环纹豹蛛安全性的影响

发布时间：2017-10-02 10:02

  本文关键词：用RNA-seq技术鉴定Bt蛋白对拟环纹豹蛛安全性的影响

  更多相关文章： Bt水稻 拟环纹豹蛛 毒腺 功能反应 繁殖能力 生长发育 酶活 转录组

【摘要】：近年来,转Bt基因粮食作物对害虫的控虫作用受到广泛的应用,它可以减少广谱杀虫剂对环境造成的污染。水稻作为亚洲国家主要的粮食作物,正面对严重的虫害问题和杀虫剂污染问题。因此,转Bt基因水稻逐渐被用来缓解这种局势。转Bt基因水稻给环境与农业生产带来巨大利益的同时,其潜在的危险同样受到关注。Bt蛋白在稻田生态系统复杂的食物网中的传递,以及对非靶标生物的影响是人们担忧的主要问题之一。本研究就试图利用转录组高通量测序技术鉴定Bt水稻对稻田蜘蛛优势种拟环纹豹蛛(Pardosa pseudoannulata)安全性的影响。内容具体如下：1.用RNA-seq技术鉴定Bt蛋白对拟环纹豹蛛捕食功能及搜寻行为的影响为了探究Bt蛋白对拟环纹豹蛛捕食功能的影响及其机理。用富集Bt蛋白的褐飞虱饲养拟环纹豹蛛,比较富集过Bt蛋白的拟环纹豹蛛与正常蜘蛛捕食功能以及搜寻行为差异,并解剖拟环纹豹蛛的神经节做转录组分析,观察Bt蛋白作用下神经节基因的表达情况。同时,随机选择了4个DEGs基因进行了qPCR验证。结果表明,Bt蛋白对拟环纹豹蛛的捕食功能没有影响,但会显著增强拟环纹豹蛛的搜寻行为。结合转录组分析,神经细胞内氧化磷酸化反应显著增强可能是拟环纹豹蛛变得兴奋的关键因素,而其体内一些次级代谢产物代谢途径的富集可能与蜘蛛体内对Bt蛋白的防御机制相关,其转录组结果与qPCR验证结果一致。2.用RNA-seq技术鉴定Bt蛋白对拟环纹豹蛛毒腺基因表达的影响Bt蛋白是一种杀虫晶体蛋白,能与昆虫肠道上皮细胞上的特异性蛋白结合,导致膜上孔洞的形成,造成昆虫的死亡。本研究利用转录组高通量测序技术,对富集了Bt蛋白的拟环纹豹蛛毒腺与正常拟环纹豹蛛毒腺进行了深度测序,得到113358条unigene。通过比对COG, GO, KEGG等数据库,对拟环纹豹蛛毒腺基因进行功能注释,并且探究了在两样本中差异表达的基因。其中上调基因3765条,下调基因3157条,主要参与的代谢途径为氧化磷酸化途径、核糖体等相关途径。本研究初步证明Bt蛋白对拟环纹豹蛛毒腺基因表达有一定影响。同时也为全方面了解蜘蛛毒腺基因组以及基因进化提供了帮助。3.用RNA-seq技术鉴定Bt蛋白对拟环纹豹蛛生长发育的影响为了探究Bt蛋白对拟环纹豹蛛生长发育的影响及其机制,通过ELISA检测来探究Bt蛋白在拟环纹豹蛛成蛛和3龄,5龄幼蛛体内各组织中的富集规律；分别记录实验组和对照组幼蛛的发育历期,体长、背甲宽、体重变化,取食量,存活率等参数；比较两组成蛛和幼蛛体内三大组织(肌肉组织,消化组织,神经节)及其亚细胞结构中5种解毒酶(POD, CAT, SOD, GSH-Px, AChE)酶活的活性。取5龄幼蛛做转录组测序分析,通过差异表达分析和功能注释了解Bt蛋白作用下实验组蜘蛛差异表达基因的生物学功能,探究Bt蛋白影响幼蛛生长发育的分子机制。同时,随机选择了4个DEGs基因进行了qPCR验证。结果表明,Bt蛋白可以在拟环纹豹蛛的各组织结构和亚细胞结构中富集,并会影响到拟环纹豹蛛的生长发育和两种关键的的酶,AChE和POD。转录组分析结果表明,幼蛛体内一些直接调控生长发育的生物学功能的改变,如生长激素受体信号途径,幼体发育,幼体龄期的发育,中肠的发育,体肌的发育等是造成发育显著延迟,体重降低的主要原因；还有一些供能物质代谢途径的改变,如糖酵解糖异生,三羧酸循环,氧化磷酸化,淀粉蔗糖的代谢,脂肪酸代谢等可能间接影响到幼蛛体内解毒酶的活性,进而直接或间接的影响到幼蛛的生长发育。其转录组结果与qPCR验证结果一致。4.用RNA-seq技术鉴定Bt蛋白对拟环纹豹蛛繁殖的影响实验室条件下研究了Bt蛋白对拟环纹豹蛛繁殖能力的影响及其分子机制。以分别取食Bt水稻或正常水稻15天的褐飞虱喂食拟环纹豹蛛,比较两组蜘蛛的繁殖能力(产卵前期、产卵量、卵袋数、孵化率)是否有差异,在宏观层面上探究Bt蛋白对拟环纹豹蛛繁殖能力的影响；取蜘蛛性腺做转录组分析,研究性腺中繁殖相关基因的表达是否受到影响,从分子层面上解释Bt蛋白对拟环纹豹蛛的作用机制。同时,我们对8个卵黄蛋白基因进行了qPCR验证。结果表明,Bt蛋白可以沿着食物链传递,从水稻通过褐飞虱在拟环纹豹蛛体内富集,其最大富集量为0.396ng/g,而拟环纹豹蛛的繁殖能力不受Bt蛋白的影响。基因差异表达分析显示,性腺中直接调控繁殖的有806个unigene,这些unigene参与到23种不同的生物学功能和4条代谢途径,且都没有差异表达；而以FDR0.01, log2fold change2筛选得到的49个显著差异表达基因参与到的生物学功能和代谢途径都不与蜘蛛的繁殖直接相关。在Cry1Ab蛋白胁迫下,8个与卵黄蛋白合成相关的基因均未发生表达差异,其转录组结果与qPCR验证结果一致。因此,Bt蛋白不影响拟环纹豹蛛的繁殖能力,其主要原因是性腺中繁殖相关基因的表达并没有受到影响。
【关键词】：Bt水稻 拟环纹豹蛛 毒腺 功能反应 繁殖能力 生长发育 酶活 转录组
【学位授予单位】：湖南农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S476.2
【目录】：

• 摘要4-7
• Abstract7-14
• 第一章 绪论14-26
• 1 问题的提出14-15
• 2 转Bt基因作物15-23
• 2.1 Bt蛋白简介15-16
• 2.2 转Bt基因作物16-17
• 2.3 转Bt基因作物对靶标生物影响的研究17-19
• 2.4 转Bt基因作物对非靶标生物影响的研究19-23
• 3 蜘蛛23-24
• 4 转录组高通量测序技术(RNA-seq技术)24-26
• 第二章 用转录组高通量测序技术鉴定Bt蛋白对拟环纹豹蛛捕食功能及搜寻行为的影响26-39
• 1 材料与方法26-28
• 1.1 实验用水稻26
• 1.2 供试褐飞虱26
• 1.3 实验用蜘蛛及其处理26
• 1.4 Bt蛋白含量测定26-27
• 1.5 捕食功能反应27
• 1.6 搜寻反应27
• 1.7 转录组测序27
• 1.8 qPCR分析(实时荧光定量PCR)27-28
• 1.9 数据处理28
• 2 结果与分析28-36
• 2.1 拟环纹豹蛛体内Cry1Ab蛋白含量随天数变化28-29
• 2.2 捕食功能反应29-30
• 2.3 搜寻反应30
• 2.4 转录组Unigene差异分析30-35
• 2.5 DEGs基因的qPCR分析35-36
• 3 结论与讨论36-39
• 第三章 用转录组高通量测序技术鉴定Bt蛋白对拟环纹豹蛛毒腺基因表达的影响39-48
• 1 材料与方法39-41
• 1.1 实验水稻39
• 1.2 稻飞虱养殖39
• 1.3 蜘蛛采集和分装39
• 1.4 试剂及试剂盒39-40
• 1.5 蜘蛛的饲养40
• 1.6 Bt蛋白检测40
• 1.7 蜘蛛毒腺解剖40
• 1.8 RNA的提取40-41
• 1.9 RNA质量检测41
• 1.10 测序41
• 1.11 数据统计41
• 2 结果与分析41-46
• 2.1 蜘蛛体内Bt蛋白含量41
• 2.2 拟环纹豹蛛的毒腺41
• 2.3 RNA质量检测41-42
• 2.4 差异表达分析42-46
• 3 讨论46-48
• 第四章 用转录组高通量测序技术鉴定Bt蛋白对拟环纹豹蛛生长发育的影响48-67
• 1 材料与方法49-51
• 1.1 供试水稻49
• 1.2 供试飞虱49
• 1.3 供试蜘蛛49
• 1.4 CrylAb蛋白检测49-50
• 1.5 酶活的测定50
• 1.6 转录组分析50
• 1.7 qPCR分析50
• 1.8 数据分析50-51
• 2 结果与分析51-64
• 2.1 Cry1Ab蛋白在拟环纹豹蛛体内的生物富集51
• 2.2 Cry1Ab蛋白对幼蛛发育历期、存活率和体重增长的影响51-53
• 2.3 Cry1Ab蛋白对幼蛛身体发育的影响53-54
• 2.4 Cry1Ab蛋白对成蛛体内各组织以及其亚细胞结构中各酶活的影响54-57
• 2.5 Cry1Ab蛋白对幼蛛体内各组织及亚细胞结构中各酶活的影响57-59
• 2.6 转录组结果分析59-63
• 2.7 DEGs基因的qPCR分析63-64
• 3. 讨论64-67
• 第五章 用转录组高通量测序技术鉴定Bt蛋白对拟环纹豹蛛繁殖的影响67-80
• 1 材料与方法68-70
• 1.1 水稻68
• 1.2 褐飞虱68
• 1.3 蜘蛛的饲养68
• 1.4 Cry1Ab的检测68-69
• 1.5 基因表达分析与功能注释69
• 1.6 qPCR检测69-70
• 1.7. 数据分析70
• 2 结果与分析70-76
• 2.1 Cry1Ab蛋白在拟环纹豹蛛体内的富集规律70-71
• 2.2 Cry1Ab蛋白对拟环纹豹蛛繁殖能力的影响71
• 2.3 基因表达分析71-75
• 2.4 卵黄蛋白基因的qPCR分析75-76
• 3 讨论76-80
• 第六章 结论、创新与展望80-82
• 1 结论80
• 2 创新点80-81
• 3 展望81-82
• 参考文献82-98
• 附录A：RNA质检结果98-100
• 附录B：转录组建库流程及Reads质量预处理100-103
• 附录C103-105
• 致谢105-106

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本文编号：958946