分子修饰狂犬病ERA疫苗株及表达埃博拉或马尔堡病毒GP重组ERA疫苗株的研究

发布时间：2017-10-03 12:03

  本文关键词：分子修饰狂犬病ERA疫苗株及表达埃博拉或马尔堡病毒GP重组ERA疫苗株的研究

  更多相关文章： 狂犬病病毒 口服疫苗 埃博拉病毒 马尔堡病毒 重组病毒 GP 免疫原性

【摘要】：Ⅰ:分子修饰狂犬病毒ERA疫苗株的研究狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)引起的一种人兽共患病,一旦出现神经症状致死率几乎达100%。全世界每年约60,000人死于该病,超过95%发生在非洲和亚洲。几乎所有的人间狂犬病死亡病例均由犬咬伤或抓伤所传播,而疫苗接种能有效防控狂犬病的肆虐。日益增多的流浪犬、散养家畜和野生动物狂犬病的存在加大了狂犬病流行区人感染狂犬病的风险,针对这些动物进行口服免疫比传统的注射免疫更具有可行性。因此,安全、有效的狂犬病口服疫苗的研发仍具有重要意义。本研究对G333位点突变成谷氨酸(E)的分子修饰狂犬病病毒ERA疫苗株(r ERAG333E)进行生物学特性分析,并对其作为犬狂犬病口服疫苗的潜力进行了评价。r ERAG333E在BSR细胞上的生长动力学曲线与亲本疫苗株ERA相似,在感染后96 h达到最高滴度(108.24 FFU/m L),与ERA的最高滴度(108.26 FFU/m L)基本一致。r ERAG333E分别在乳鼠脑内连续传5代和NA细胞上连续传20代,其G333E突变不发生回复突变,具有遗传稳定性。r ERAG333E的体外嗜神经指数(neurotropism index,NI)为0,不具有体外嗜神经性,而ERA的NI为0.4。将r ERAG333E和ERA分别按1×106和1×105 FFU/30μL/只的剂量颅内接种感染成年BALB/c小鼠和乳鼠,r ERAG333E感染组成年小鼠未见任何明显的狂犬病症状,而r ERA感染组成年小鼠14日内全部死亡,表明G333E突变失去了ERA疫苗株对成年小鼠的致病力;r ERAG333E和r ERA均能致死乳鼠,但r ERAG333E感染组乳鼠的死亡进程较r ERA感染组推后了2天,表明G333E突变降低了ERA株对乳鼠的致病力。将r ERAG333E经肌肉途径接种BALB/c小鼠和比格犬,可诱导显著的RABV中和抗体反应,并对小鼠提供完全的攻毒保护,表明r ERAG333E株对小鼠和犬均具有良好的免疫原性。为进一步评估r ERAG333E的口服免疫效力,将r ERAG333E分别按106、107、108 FFU/100μL/只的剂量经口服途径接种小鼠,均可诱导显著、持续1年以上的RABV中和抗体反应,免疫后1年各免疫组小鼠均能获得完全攻毒保护。同时,将r ERAG333E分别按108、109 FFU/1,000μL/只的剂量经口服途径1次接种或间隔55周2次接种比格犬。结果显示,1次接种组口服接种犬能诱导显著的RABV中和抗体反应,免疫后156周109 FFU和108 FFU剂量组犬血清RABV中和抗体滴度平均值分别为1.24 IU/m L和0.34 IU/m L(2/40.5 IU/m L);2次接种组初次免疫后55周,109和108 FFU剂量组犬血清RABV中和抗体滴度平均值分别为1.54 IU/m L和2.71 IU/m L,加强免疫后能诱导显著的免疫记忆效应,加强免疫后104周109和108FFU剂量组犬血清RABV中和抗体滴度平均值分别为1.80 IU/m L和1.61 IU/m L;此外,r ERAG333E口服免疫后4周109和108FFU剂量组犬唾液RABV特异性Ig A转阳率分别为50%(5/10)和60%(6/10)。上述所有免疫犬均未出现任何狂犬病相关症状。本研究结果表明,分子修饰的ERA株r ERAG333E对犬具有良好的安全性,能诱导犬产生持续三年以上的中和抗体反应,以及特异性黏膜Ig A反应,具有作为犬狂犬病口服疫苗的潜力。Ⅱ:表达埃博拉或马尔堡病毒GP重组ERA疫苗株的研究埃博拉出血热(Ebola hemorrhagic fever,EHF)和马尔堡出血热(Marburg hemorrhagic fever,MHF)分别由埃博拉病毒(Ebola virus,EBOV)和马尔堡病毒(Marburg virus,MBGV)引起,均为烈性人畜共患病,以发热、急性出血、高发病率和高死亡率为特征。EHF和MHF均能在人间传播,并能感染蝙蝠等多种野生动物和犬、猪等强流动性家畜,该类病一旦发生将造成严重的公共安全问题。到目前为止仍无官方许可的人用EHF和MHF疫苗投入使用,并且通过注射途径免疫野生动物和流动性强的家养动物以清除传染源和切断传播途径显得极其困难。因此,研制有效的EHF或MHF人用灭活疫苗和动物口服疫苗显得尤为紧迫和重要。本研究以狂犬病候选口服疫苗株r ERAG333E为活病毒载体,分别构建了表达扎伊尔EBOV(ZEBOV)、苏丹EBOV(SEBOV)或MBGV的野生型GP(wt-G)或密码子优化GP(co-G)的重组病毒r ERAG333E/ZGP、r ERAG333E/ZGPGCD、r ERAG333E/SGP、r ERAG333E/SGPGCD、r ERAG333E/MGP和r ERAG333E/MGPGCD。这些重组RABVs能够正确地表达外源蛋白,并具有与载体病毒r ERAG333E相似的BSR细胞生长适应性和稳定性。分别通过将埃博拉相关重组病毒颅内感染成年小鼠和乳鼠及马尔堡相关重组病毒口服和肌肉感染成年小鼠,感染后的成年小鼠均未见任何明显的狂犬病症状,而感染后乳鼠的死亡进程与载体组相似,结果表明EBOV或MBGV GP基因的插入和表达没有增强载体病毒对小鼠的致病力。为评估埃博拉相关重组RABVs对小鼠的免疫原性,将重组病毒r ERAG333E/ZGP、r ERAG333E/ZGPGCD、r ERAG333E/SGP、r ERAG333E/SGPGCD和亲本株r ERAG333E在小鼠模型上分别口服或肌肉1次接种活病毒或间隔3周2次肌肉接种灭活的病毒培养物。结果显示,埃博拉相关重组RABVs按以上三种不同的途径/剂型免疫接种小鼠,均能诱导持续13周的高水平RABV中和抗体(RABV VNA)和抗ZEBOV或SEBOV GP假病毒中和抗体(ZEBOV或SEBOV VNA)反应。此外,重组RABVs分别经以上三种途径/剂型免疫接种小鼠均能诱导产生抗ZEBOV或SEBOV GP的Ig G和Ig G2a反应;与活病毒和灭活病毒肌肉接种组相比,口服接种组小鼠血清中的Ig G水平略低,但Ig G2a维持在相似的水平。分别表达EBOV wt-G或co-G的重组RABVs经以上三种不同的途径/剂型接种小鼠,诱导的RABV、ZEBOV或SEBOV VNA反应及相应的Ig G及Ig G2a水平无显著差异。结果表明,重组病毒r ERAG333E/ZGP、r ERAG333E/ZGPGCD、r ERAG333E/SGP和r ERAG333E/SGPGCD经口服接种活病毒或肌肉接种灭活病毒均具有良好的免疫原性。为评估马尔堡相关重组RABVs对小鼠的免疫原性,将重组病毒r ERAG333E/MGP、r ERAG333E/MGPGCD和亲本株r ERAG333E在小鼠模型上分别口服或肌肉1次接种活病毒或间隔3周2次肌肉接种灭活的病毒培养物。结果显示,r ERAG333E/MGP和r ERAG333E/MGPGCD按三种不同的途径/剂型免疫接种小鼠,均能诱导高水平的RABV VNA反应和抗MBGV假病毒中和抗体反应(MBGV VNA);初次免疫后5周能完全保护所有免疫小鼠抵抗致死量RABV街毒株GX/09的攻击;分别表达MBGV wt-G或co-G的重组RABVs经以上三种不同的途径/剂型免疫小鼠,诱导的RABV和MBGV VNA水平无显著差异。结果表明,重组病毒r ERAG333E/MGP和r ERAG333E/MGPGCD经口服接种活病毒或肌肉接种灭活病毒均具有良好的免疫原性。本研究结果表明,重组病毒r ERAG333E/ZGP、r ERAG333E/ZGPGCD、r ERAG333E/SGP、r ERAG333E/SGPGCD、r ERAG333E/MGP和r ERAG333E/MGPGCD在小鼠模型上均具有良好的安全性和免疫原性,分别有希望作为防控扎伊尔、苏丹埃博拉出血热或马尔堡出血热与狂犬病的二联动物口服疫苗和人用灭活疫苗。
【关键词】：狂犬病病毒 口服疫苗 埃博拉病毒 马尔堡病毒 重组病毒 GP 免疫原性
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S855.3
【目录】：

• 摘要6-9
• Abstract9-17
• 英文缩略表17-18
• 第一章 绪论18-34
• 1.1 引言18
• 1.2 狂犬病病毒18-23
• 1.2.1 分类18-19
• 1.2.2 形态结构19-20
• 1.2.3 蛋白结构与功能20-23
• 1.2.3.1 核蛋白20
• 1.2.3.2 磷蛋白20-21
• 1.2.3.3 基质蛋白21
• 1.2.3.4 糖蛋白21-22
• 1.2.3.5 依赖RNA的RNA聚合酶蛋白22-23
• 1.3 狂犬病流行病学概况23-24
• 1.3.1 人间狂犬病23
• 1.3.2 家养动物狂犬病23-24
• 1.3.3 野生动物狂犬病24
• 1.4 狂犬病疫苗概况24-27
• 1.4.1 人用狂犬病疫苗24-25
• 1.4.1.1 神经组织疫苗24
• 1.4.1.2 禽胚疫苗24-25
• 1.4.1.3 细胞培养疫苗25
• 1.4.2 兽用狂犬病疫苗25-27
• 1.4.2.1 注射用疫苗25
• 1.4.2.2 口服疫苗25-27
• 1.5 狂犬病病毒载体概况27-28
• 1.6 埃博拉病毒概况28-29
• 1.7 埃博拉出血热流行病学概况29-30
• 1.8 埃博拉出血热疫苗概况30
• 1.9 马尔堡病毒概况30-31
• 1.10 马尔堡出血热流行病学概况31-32
• 1.11 马尔堡出血热疫苗概况32
• 1.12 本研究的目的和意义32-34
• 第二章 分子修饰狂犬病毒ERA疫苗株的生物学特性与.服免疫学研究34-50
• 2.1 材料与方法34-37
• 2.1.1 细胞与病毒株34
• 2.1.2 实验动物34
• 2.1.3 主要试剂和仪器34
• 2.1.4 病毒的制备及滴定34-35
• 2.1.5 rERAG_333E株的生长动力学曲线的测定35
• 2.1.6 rERAG_333E株的遗传稳定性鉴定35
• 2.1.7 rERAG_333E株的致病力分析35-36
• 2.1.8 rERAG_333E株的免疫原性分析36
• 2.1.9 rERAG_333E株.服免疫BABL/c小鼠36
• 2.1.10 rERAG_333E株.服免疫比格犬36-37
• 2.1.11中和试验37
• 2.1.12酶联免疫吸附试验（ELISA）37
• 2.2 结果37-47
• 2.2.1 rERAG_333E株具有与亲本株相似的生长动力学37-38
• 2.2.2 rERAG_333E株糖蛋白333位点的氨基酸突变具有遗传稳定性38-39
• 2.2.3 G_333E突变使ERA株失去嗜神经性及对成年BABL/c小鼠的致病力39-41
• 2.2.4 rERAG_333E株对BABL/c小鼠和比格犬肌肉接种的免疫效力41-43
• 2.2.5 rERAG_333E株.服免疫BABL/c小鼠诱导持久、高水平中和抗体反应并提供完全攻毒保护43-44
• 2.2.6 rERAG_333E株.服免疫比格犬安全且能诱导长达三年的中和抗体和适量的唾液抗狂犬病病毒特异性IgA反应44-47
• 2.3 讨论47-50
• 第三章 狂犬病毒RERAG_333E株载体埃博拉病毒疫苗的研究50-67
• 3.1 实验材料50-51
• 3.1.1 细胞与病毒株50
• 3.1.2 质粒50
• 3.1.3 主要试剂和仪器50-51
• 3.1.4 实验动物51
• 3.1.5 引物设计与合成51
• 3.2 实验方法51-56
• 3.2.1 含扎伊尔、苏丹埃博拉病毒野生型或密码子优化的GP基因的重组rERAG_333E基因组全长cDNA克隆的构建51-52
• 3.2.2 重组病毒的拯救52-53
• 3.2.3 间接免疫荧光53
• 3.2.4 种毒的制备及滴定53
• 3.2.5 Western bloting53
• 3.2.6 重组病毒生长动力学曲线的测定53-54
• 3.2.7 重组病毒遗传稳定性鉴定54
• 3.2.8 重组病毒对BABL/c小鼠的致病力分析54
• 3.2.9 灭活疫苗的制备54
• 3.2.10 重组病毒对BABL/c小鼠的免疫实验54-55
• 3.2.11 中和试验55
• 3.2.12 ELISA55-56
• 3.3 结果56-65
• 3.3.1 含ZEBOV wt-G或co-GP基因、SEBOV wt-G或co-GP基因的重组RABV基因组全长cDNA克隆的构建56
• 3.3.2 病毒的拯救56
• 3.3.3 间接免疫荧光检测救获的重组病毒56-58
• 3.3.4 Western bloting58
• 3.3.5 重组病毒具有与亲本株相似的生长动力学58-59
• 3.3.6 重组病毒具有遗传稳定性59
• 3.3.7 埃博拉病毒GP基因的插入和表达没有增强载体病毒对小鼠的致病力59-60
• 3.3.8 重组病毒不同途径免疫BABL/c小鼠引起高水平抗狂犬病病毒和埃博拉病毒中和抗体60-63
• 3.3.9 重组病毒不同途径免疫BABL/c小鼠引起高水平抗埃博拉GP的IgG及IgG2a反应63-65
• 3.4 讨论65-67
• 第四章 狂犬病毒RERAG_333E株载体马尔堡病毒疫苗的研究67-78
• 4.1 实验材料67
• 4.2 实验方法67-70
• 4.2.1含马尔堡病毒野生型或密码子优化的GP基因的重组rERAG_333E基因组全长cDNA克隆的构建67-68
• 4.2.2 重组病毒的拯救68
• 4.2.3 间接免疫荧光68-69
• 4.2.4 种毒的制备及滴定69
• 4.2.5 Western bloting69
• 4.2.6 重组病毒生长动力学曲线的测定69
• 4.2.7 重组病毒遗传稳定性鉴定69
• 4.2.8 灭活病毒的制备69
• 4.2.9 重组病毒对BABL/c小鼠的致病力分析69
• 4.2.10重组病毒对BABL/c小鼠的免疫69-70
• 4.2.11中和试验70
• 4.3 结果70-76
• 4.3.1 含MBGV wt-G或co-GP基因的重组RABV基因组全长cDNA克隆的构建70
• 4.3.2 病毒的拯救70
• 4.3.3 间接免疫荧光检测救获的重组病毒70-71
• 4.3.4 Western bloting71-72
• 4.3.5 重组病毒具有与亲本株相似的生长动力学72-73
• 4.3.6 重组病毒具有遗传稳定性73
• 4.3.7 重组病毒.服和肌肉接种对小鼠均无致病力73-74
• 4.3.8 重组病毒对BABL/c小鼠的免疫效力74-76
• 4.4 讨论76-78
• 第五章 全文结论78-79
• 参考文献79-105
• 附录105-114
• 致谢114-115
• 个人简历115

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