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大麦草酸氧化酶与WRKY转录因子参与调控核盘菌抗性的分子机理

发布时间:2017-10-03 21:16

  本文关键词:大麦草酸氧化酶与WRKY转录因子参与调控核盘菌抗性的分子机理


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【摘要】:菌核病是我国油的主要油菜病害之一,对我国油菜生产造成了严重的影响;对于油菜对菌核病的反应机制的研究有助于我们了解油菜-菌核病互作,对于我们油菜抗病育种具有重要意义。研究工作主要分两个方面进行的:1.核盘菌在侵染植物时会分泌草酸以帮助其入侵植物组织,而草酸氧化酶可以分解草酸为二氧化碳和过氧化氢,我们通过农杆菌转化的方法将大麦草酸氧化酶(Y14203)转入甘蓝型油菜,提高了对菌核病的抗性。在接种核盘菌72h后,与对照相比,转基因植株的病斑面积减少15-61%,表现出对核盘菌显著的叶片抗性。而且,转基因植株接种核盘菌后的草酸盐水平下降,同时伴随过氧化氢水平的上升。另外,涉及到过氧化氢信号路径的基因表达水平在转基因植株中表现出上升的趋势。因此,我们将转化大麦草酸氧化酶基因提升抗性的原因归结为增强植株对草酸盐的代谢升高的过氧化氢水平以及过氧化氢信号路径上的基因表达水平的上升。2.基于本实验室之前抑制性差减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)的结果,检测并分离到一个受到核盘菌诱导上调表达的基因Bn WRKY33;基于内含子多态性标记,将其定位于A5连锁群上;在Westar材料中过表达Bn WRKY33可以提高核盘菌抗性,而且在转基因植株中合成camalexin的基因表现出上调表达;对其启动子分析发现其受到水杨酸及核盘菌的诱导,对启动子进行截短实验获得含有3个W-box的受到核盘菌诱导的区段,利用这个区段进行酵母单杂交筛选Bn WRKY33上游调控其转录水平的转录因子,结果筛选到一个与At WRKY15同源的WRKY转录因子Bn WRKY15;利用EMSA和拟南芥原生质体瞬时表达验证了这种互作的真实性,同时也检测到Bn WRKY33与这段区域的结合;转录激活检测发现Bn WRKY15是一个弱的转录激活子,而Bn WRKY33是一个典型的转录激活子,转录激活/抑制结构域作图发现Bn WRKY33存在两个转录激活结构域,而Bn WRKY15存在一个转录抑制结构域;Bn WRKY15在拟南芥原生质体中会降低Bn WRKY33对自身的转录激活,同时在Bn WRKY15过表达植株中Bn WRKY33及其调控合成camalexin相关的基因都表现出表达量下降的情况,并且过表达植株的菌核病抗性初步鉴定也表现出抗性下降;利用转录激活和EMSA竞争性试验研究发现Bn WRKY15对Bn WRKY33对自身激活能力的影响机制可以归结为两个方面:1.Bn WRKY15抑制Bn WRKY33的转录激活能力;2.Bn WRKY15与Bn WRKY33一起竞争WRKY33启动子上的W-box,而且Bn WRKY15具有更强的W-box结合能力。另外,也检测到受核盘菌诱导表达的Bn WRKY28和Bn WRKY40也可以结合到Bn WRKY33的启动子上,说明Bn WRKY33在植物环境的刺激反应中可能处于调控的中心。
【关键词】:甘蓝型油菜 核盘菌 大麦草酸氧化酶 WRKY33 WRKY15
【学位授予单位】:华中农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:S432.4
【目录】:
  • 摘要8-10
  • Abstract10-12
  • 缩略语表12-13
  • 第一章 文献综述13-30
  • 1 病菌的生物学特性13-17
  • 1.1 菌核病的基本介绍13
  • 1.2 核盘菌的生物学特性13-15
  • 1.3 核盘菌致病机理15-16
  • 1.3.1 核盘菌对植物的入侵过程15
  • 1.3.2 草酸在核盘菌浸染中的重要性15-16
  • 1.4 油菜菌核病抗性分子机制研究进展16-17
  • 1.4.1 转录水平研究植物对核盘菌的反应16-17
  • 1.4.2 蛋白组水平研究植物对核盘菌的反应17
  • 2 WRKY转录因子17-30
  • 2.1 WRKY转录因子的结构与分类18-20
  • 2.2 W-box20-23
  • 2.3 WRKY转录因子互作蛋白23-27
  • 2.3.1 WRKY-WRKY之间的互作23
  • 2.3.2 WRKY蛋白与VQ蛋白之间的互作23-25
  • 2.3.3 WRKY转录因子与MAPK之间的互作25-26
  • 2.3.4 与WRKY蛋白互作的其他蛋白26-27
  • 2.4 WRKY转录因子的生物学功能27-30
  • 2.4.1 WRKY蛋白参与植物防卫反应信号的传递28
  • 2.4.2 WRKY转录因子在植物发育过程中的作用28-30
  • 第二章 转化大麦草酸氧化酶提高甘蓝型油菜菌核病抗性及其抗性机理初析30-55
  • 1 材料与方法30-40
  • 1.1 试验材料30-31
  • 1.2 大麦草酸氧化酶基因片段的获得及植物转化载体构建31-34
  • 1.3 植物转化载体转化农杆菌34
  • 1.4 甘蓝型油菜转基因植株的获得34-35
  • 1.5 草酸氧化酶酶活测定35-36
  • 1.6 转基因植株菌核病抗性鉴定36
  • 1.7 对油菜叶片用过氧化氢及脱落酸(abscisic acid, ABA)进行处理36
  • 1.8 检测转基因植株的过氧化氢水平与草酸盐水平36-37
  • 1.9 DNA提取及基于PCR水平对转基因单株的鉴定37-38
  • 1.10 RNA分离及定量PCR38-40
  • 2 结果与分析40-52
  • 2.1 植物表达载体的构建及转基因植株的获得40-41
  • 2.2 转基因油菜植株的获得及抗性鉴定41
  • 2.3 转基因植株菌核病抗性鉴定41-44
  • 2.4 转基因植株的草酸氧化酶酶活测定以及接种核盘菌后草酸盐含量测定44-45
  • 2.5 草酸氧化酶酶活的升高是与过氧化氢水平的升高是相关的45-47
  • 2.6 过氧化氢途径相关的基因在转基因材料中被激活47-50
  • 2.7 转基因植株表现出对外施ABA的敏感性50-52
  • 3 讨论52-55
  • 3.1 转BOXO基因可以高甘蓝型油菜对核盘菌的抗性52
  • 3.2 H_2O_2及其途径上相关基因对抗性的贡献52-54
  • 3.3 ABA与菌核病抗性的关系54-55
  • 第三章 WRKY15可以调控WRKY33对菌核病的抗性55-105
  • 1 材料与方法55-69
  • 1.1 试验材料55
  • 1.2 油菜水的杨酸处理及核盘菌接种55-56
  • 1.3 RNA提取及q PCR56
  • 1.4 载体构建56-61
  • 1.4.1 过表达载体构建56-57
  • 1.4.2 RNAi载体构建57
  • 1.4.3 启动子分离及启动子载体构建57-59
  • 1.4.4 亚细胞定位载体构建59-60
  • 1.4.5 原核表达载体构建60
  • 1.4.6 Bradford法蛋白定量60
  • 1.4.7 原生质体瞬时表达载体构建60-61
  • 1.4.8 酵母单杂载体构建61
  • 1.5 油菜的农杆菌转化及PCR鉴定61-62
  • 1.6 拟南芥的农杆菌转化62
  • 1.7 转基因材料的PCR检测62
  • 1.8 拟南芥原生质体的转化62-63
  • 1.9 亚细胞定位63-64
  • 1.10 GUS染色64-65
  • 1.11 酵母文库的构建及筛库65-68
  • 1.12 原核表达68
  • 1.13 凝胶阻滞电泳68
  • 1.14 原生质体的瞬时表达68-69
  • 2 结果与分析69-98
  • 2.1 Bn WRKY33在染色体上的定位及序列分析69-71
  • 2.2 Bn WRKY33受到水杨酸和核盘菌的诱导表达71-72
  • 2.3 Bn WRKY33基因的亚细胞定位72-73
  • 2.4 Bn WRKY33参与甘蓝型油菜对菌核病的抗性73-75
  • 2.5 Bn WRKY33过表达提高camalexin合成途径基因的表达75
  • 2.6 Bn WRKY33启动子表达模式分析75-76
  • 2.7 Bn WRKY33启动子截短分析76-77
  • 2.8 酵母文库的构建及筛选77-81
  • 2.9 凝胶阻滞电泳体外验证Bn WRKY15、Bn WRKY33与W-box的结合81-83
  • 2.10 原生质体瞬时表达检测Bn WRKY15、Bn WRKY33与W-box的结合83-85
  • 2.11 Bn WRKY15的生物信息学分析85-86
  • 2.12 Bn WRKY15的表达模式86-88
  • 2.13 Bn WRKY15的亚细胞定位88-89
  • 2.14 Bn WRKY15与Bn WRKY33的转录激活活性89-91
  • 2.15 Bn WRKY15和Bn WRKY33的转录激活或抑制结构域的作图91-93
  • 2.16 Bn WRKY15对Bn WRKY33转录调控的影响机制93-95
  • 2.17 其他WRKY类转录因子对WRKY33的调控95-97
  • 2.18 Bn WRKY15过表达甘蓝型油菜表型鉴定97-98
  • 3 讨论98-105
  • 3.1 Bn WRKY33参与油菜对核盘菌的抗性98-99
  • 3.2 Bn WRKY33启动子上其他两个W-box的作用99-100
  • 3.3 Bn WRKY33参与对自身的信号放大效应100-101
  • 3.4 Bn WRKY15对Bn WRKY33的调控机制101-102
  • 3.5 Bn WRKY15对于Bn WRKY33的调控作用102-103
  • 3.6 Bn WRKY33在植物对环境刺激的反应中起着调控中心的作用103-105
  • 参考文献105-117
  • 致谢117-119
  • 附录1 甘蓝型油菜农杆菌转化所用的培养基与试剂配方119-120
  • 附录2 Hoagland营养液配方120-121
  • 作者简介及在读期间发表论文121

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前5条

1 李蕾,谢丙炎,戴小枫,杨宇红;WRKY转录因子及其在植物防御反应中的作用[J];分子植物育种;2005年03期

2 田云;卢向阳;彭丽莎;方俊;;植物WRKY转录因子结构特点及其生物学功能[J];遗传;2006年12期

3 王丽;王晓丽;刘佳;衣志刚;董志敏;;植物草酸氧化酶及其基因的研究进展[J];中国农学通报;2010年07期

4 皇甫海燕;官春云;;甘蓝型油菜抗菌核病近等基因系和感病亲本蛋白差异的初步研究[J];中国农业科学;2010年10期

5 李方球,官春云;油菜菌核病抗性鉴定、抗性机理及抗性遗传育种研究进展[J];作物研究;2001年03期

中国硕士学位论文全文数据库 前1条

1 张伟杰;甘蓝型油菜抗应答盘菌侵染早期表达模式分析[D];华中农业大学;2006年



本文编号:966774

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