唐古特白刺悬浮细胞体系的构建及耐盐代谢机制研究

发布时间：2017-10-07 13:47

  本文关键词：唐古特白刺悬浮细胞体系的构建及耐盐代谢机制研究

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【摘要】：唐古特白刺(Nitraria tangutorum Bobr.)属蒺藜科(Zygophyllaceae)白刺属(Nitraria L.)灌木,是我国特有白刺种之一,是典型的稀盐型盐生植物,具有较强的耐盐和抗旱能力,是荒漠、半荒漠和盐渍化土地上的重要建群种或优势种。因此,研究其耐盐代谢机理对培育耐盐新品种及发现耐盐新途径具有重要意义。本研究以唐古特白刺为材料,构建了稳定、快速生长的悬浮细胞体系,研究了其生长特性,进而研究了盐胁迫下细胞的生长速度、渗透调节物、膜损伤程度及抗氧化酶活性的变化情况;再利用代谢组学方法研究了不同盐浓度胁迫下唐古特白刺悬浮细胞代谢谱的差异,筛选出细胞耐盐标志性代谢物,并分析了代谢物对盐胁迫的响应,通过构建细胞在盐胁迫下的主要代谢途径,分析了代谢物之间的代谢关联性,探索了唐古特白刺细胞适应盐胁迫的重要生理代谢调控机制。主要结果归纳如下:1.唐古特白刺的茎段诱导出愈伤组织的能力高于叶片。筛选出诱导愈伤组织和悬浮细胞继代培养的最佳激素配比为2,4-D 1.5 mg?L-1、NAA 0.2 mg?L-1、6-BA 0.4 mg?L-1。细胞悬浮培养最佳接种方式为7.5 m L母液于含有30 m L MS液体培养基的100 m L锥形瓶中,摇床上黑暗培养,转速120 r?min-1,温度26~28℃,继代培养最佳时间为接种后的第9 d。在继代培养的第3 d,细胞活力达到最高值,吸光度为0.69,细胞代谢最为旺盛;第7 d细胞分裂指数达到最高值,为5.1%,即分裂比较旺盛。细胞的存活率在细胞生长延迟期和稳定期较对数期下降略快,但均保持在84%-93%之间。2.盐胁迫对唐古特白刺悬浮细胞的生长影响明显。低盐浓度(100 mmol?L-1)促进细胞生长,细胞最快达到快速生长中期,能达到的生长极限值最大,为0.9379 mg?m L-1;高盐浓度(≥150 mmol?L-1)抑制细胞生长,达到快速生长中期时间延后,生长极限值降低。从细胞生长的临界浓度(C50)可知,唐古特白刺悬浮细胞耐盐阈值高达227 mmol?L-1,表明其具有较强的耐盐能力。3.盐胁迫下唐古特白刺悬浮细胞可通过改变渗透调节物的含量和抗氧化酶的活性来适应盐环境。在低盐浓度下(100 mmol?L-1),可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸3种渗透调节物含量增加,随培养时间的延长呈增加趋势,而在高盐浓度下(≥150 mmol?L-1),随培养时间的延长呈先增加后降低的趋势,且浓度越高达到最高值的时间越早,而可溶性糖表现更为突出。在100 mmol?L-1盐处理下,MDA含量随培养时间延长呈上升趋势,而在150、200、250 mmol?L-1的盐处理组中MDA含量随培养时间延长呈先迅速增长而后趋于平衡的趋势。与此同时,SOD和POD的活性和MDA含量变化基本一致,即抗氧化酶修复速度和细胞膜氧化速度变化一致。SOD活性到达最高值的时间较POD更早,是抗氧化调节的第一道防线。从各生理指标的相关性分析中可知,细胞鲜质量与可溶性糖和MDA的含量分别呈极显著(P0.01)和显著(P0.05)负相关,MDA含量和SOD、POD活性呈极显著正相关(P0.01),可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸含量间呈极显著正相关(P0.01),渗透调节物质含量和酶类活性之间呈极显著正相关(P0.01)。表明唐古特白刺悬浮细胞通过增加可溶性糖来缓减渗透胁迫,以提高抗氧化酶活性来清除超氧自由基保护膜脂,且渗透调节和抗氧化调节同时进行并相互关联。4.分析了盐胁迫下唐古特白刺悬浮细胞的代谢谱变化。利用GC-TOF/MS从盐胁迫处理下的唐古特白刺悬浮细胞水相和有机相代谢物提取液中分别检测到373和629个物质峰,通过PLS-DA模型建立、统计分析和数据库检索,最终筛选并鉴定出25种具有潜在耐盐标志性的代谢物,即:果糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖等糖类,脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸等氨基酸,苹果酸、琥珀酸、草酸、苯甲酸、苯二甲酸、丁酸、壬二酸、丁二胺、乙酰胺、已二胺等有机酸和胺类,十八碳烯酸、十八烷酸、十六烷酸、亚麻酸、二十碳烷、十二烷等脂肪酸,以及植物甾醇谷甾醇。5.在分析唐古特白刺悬浮细胞响应盐胁迫的主要代谢物组成和相对含量的基础上,构建了其响应盐胁迫的主要代谢途径,包括糖类代谢、氨基酸代谢、脂肪酸代谢、三羧酸循环等代谢途径。其中盐胁迫下糖类代谢活跃,葡萄糖、半乳糖、甘露糖含量呈增加趋势,果糖和木糖含量呈降低趋势;氨基酸代谢旺盛,盐胁迫下其含量(脯氨酸、缬氨酸、丙氨酸)升高,脯氨酸含量尤为突出,在250 mmol?L-1处理下,细胞脯氨酸含量约是无盐组的100倍;脂肪酸代谢速度加快,十六烷酸、十八烷酸、十八碳烯酸含量升高,在低盐浓度下(100 mmol?L-1)即可达到最高值;有机酸类代谢比较稳定,苹果酸、琥珀酸、草酸、苯甲酸、苯二甲酸等的相对含量变化不大;谷甾醇含量增高。由此可知,唐古特白刺悬浮细胞通过对糖类、氨基酸、脂肪酸、有机酸、甾醇等物质的代谢调节协同增强了其抗盐能力。综上所述,本研究建立了唐古特白刺悬浮细胞悬浮培养体系,分析其盐胁迫下的生长和生理指标,确定了细胞的耐盐阈值;检测并筛选出唐古特白刺悬浮细胞耐盐标志性代谢物25种,并分析了其代谢调节方式,阐释了唐古特白刺适应盐胁迫代谢机制。相关研究结果将为白刺耐盐机理的进一步研究及对耐盐新品种的筛选、耐盐新途径的发现提供优良材料和理伦依据。
【关键词】：唐古特白刺 悬浮细胞 耐盐性 代谢组学 代谢机制 生理指标
【学位授予单位】：中国林业科学研究院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S793.9
【目录】：

• 摘要5-8
• Abstract8-18
• 第一章 绪论18-37
• 1.1 引言18-19
• 1.1.1 研究背景18-19
• 1.1.2 研究目的和意义19
• 1.2 国内外研究现状与发展趋势19-34
• 1.2.1 植物耐盐生理机制的研究现状19-22
• 1.2.2 代谢组学概述22-27
• 1.2.3 代谢组学在植物逆境胁迫研究中的应用27-32
• 1.2.4 唐古特白刺的研究现状32-34
• 1.3 研究目标和主要研究内容34-36
• 1.3.1 关键的科学问题34
• 1.3.2 研究目标34
• 1.3.3 主要研究内容34-36
• 1.4 研究技术路线36-37
• 第二章 唐古特白刺悬浮细胞体系的建立及生长特性37-53
• 2.1 引言37-38
• 2.2 材料与方法38-42
• 2.2.1 试验材料38
• 2.2.2 试验方法38-40
• 2.2.3 测定指标与方法40-42
• 2.3 结果与分析42-50
• 2.3.1 茎段和叶片的表面灭菌效果42-43
• 2.3.2 不同外源激素对茎段和叶片愈伤组织诱导的影响43-45
• 2.3.3 唐古特白刺愈伤组织的形态分析45-46
• 2.3.4 唐古特白刺悬浮细胞培养中的的生长特性46-47
• 2.3.5 唐古特白刺悬浮细胞培养中接种量对细胞生长的影响47-48
• 2.3.6 唐古特白刺悬浮细胞培养中分裂指数的变化48-49
• 2.3.7 唐古特白刺悬浮细胞培养中细胞活力与存活率的变化49-50
• 2.4 讨论50-52
• 2.4.1 唐古特白刺悬浮细胞体系的构建50-51
• 2.4.2 唐古特白刺悬浮细胞体系的生长特征51-52
• 2.5 小结52-53
• 第三章 盐胁迫下唐古特白刺悬浮细胞的生长与生理特性53-75
• 3.1 引言53-54
• 3.2 材料与方法54-59
• 3.2.1 试验材料54
• 3.2.2 试验方法54
• 3.2.3 测定指标与方法54-59
• 3.2.4 数据处理及分析59
• 3.3 结果与分析59-70
• 3.3.1 不同盐处理下唐古特白刺悬浮细胞的生长特征59-61
• 3.3.2 盐胁迫下唐古特白刺悬浮细胞的耐盐阈值61-62
• 3.3.3 不同盐处理对唐古特白刺悬浮细胞有机渗透物质的影响62-65
• 3.3.4 不同盐处理对唐古特白刺悬浮细胞抗氧化酶活性的影响65-67
• 3.3.5 不同盐处理对唐古特白刺悬浮细胞膜损伤的影响67-68
• 3.3.6 唐古特白刺悬浮细胞盐胁迫下各指标间的相关分析68-70
• 3.4 讨论70-73
• 3.4.1 盐胁迫对唐古特白刺悬浮细胞生长的影响70
• 3.4.2 唐古特白刺悬浮细胞的耐盐阈值70
• 3.4.3 盐胁迫对唐古特白刺悬浮细胞生理生化的影响70-73
• 3.5 小结73-75
• 第四章 盐胁迫下唐古特白刺悬浮细胞的代谢组学分析75-105
• 4.1 引言75-76
• 4.2 材料与方法76-78
• 4.2.1 试验材料76
• 4.2.2 试验方法76
• 4.2.3 测定指标与方法76-78
• 4.2.4 数据处理及分析78
• 4.3 结果与分析78-99
• 4.3.1 细胞相对生物量、形态、渗透势的影响78-81
• 4.3.2 盐胁迫下唐古特白刺悬浮细胞代谢物的代谢谱分析81-83
• 4.3.3 盐胁迫下唐古特白刺悬浮细胞标志代谢物及其相关分析83-99
• 4.4 讨论99-103
• 4.4.1 盐胁迫对细胞生物量、形态和渗透势的影响99
• 4.4.2 盐胁迫对细胞代谢谱的影响99-100
• 4.4.3 盐胁迫对细胞糖类代谢途径的影响100-101
• 4.4.4 盐胁迫对细胞氨基酸类代谢途径的影响101-102
• 4.4.5 盐胁迫对细胞脂肪酸类代谢途径的影响102
• 4.4.6 盐胁迫对其他代谢途径的影响102-103
• 4.5 小结103-105
• 第五章 结论与讨论105-111
• 5.1 主要研究结论105-108
• 5.1.1 唐古特白刺悬浮细胞体系的建立及生长特性105-106
• 5.1.2 盐胁迫下唐古特白刺悬浮细胞的生长与生理响应106-107
• 5.1.3 盐胁迫下唐古特白刺悬浮细胞代谢组的变化107-108
• 5.2 讨论108-110
• 5.3 展望110-111
• 参考文献111-126
• 附录126-127
• 在读期间的学术研究127-128
• 致谢128

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 曾玲玲;季生栋;王俊强;张成亮;赵刚;;植物耐盐机理的研究进展[J];黑龙江农业科学;2009年05期

2 马焕成,王沙生;胡杨膜系统的盐稳定性及盐胁迫下的代谢调节[J];西南林学院学报;1998年01期

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本文编号：988205