西花蓟马嗅觉相关蛋白鉴定及功能研究

发布时间：2017-10-07 12:32

  本文关键词：西花蓟马嗅觉相关蛋白鉴定及功能研究

  更多相关文章： 西花蓟马 嗅觉相关蛋白 分子克隆 原核表达 表达谱 荧光竞争结合 免疫定位

【摘要】：昆虫嗅觉系统在其觅食、寻偶、选择产卵场所等过程中发挥着至关重要的作用,参与此过程的蛋白主要有气味结合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)、化学感受蛋白(chemosensory proteins,CSPs)、气味受体(olfactory receptors,ORs)、气味降解酶(odorant degrading enzymes,ODEs)以及感觉神经元膜蛋白(sensory neuron membrane proteins,SNMPs)等。西花蓟马Frankliniella occidentalis(Pergande),又名苜蓿蓟马,隶属缨翅目(Thysanoptera)蓟马科(Thripidae)花蓟马属Frankliniella,目前已成为世界性的危险性入侵害虫。本研究通过开展西花蓟马嗅觉相关蛋白基因克隆、时空表达、蛋白表达纯化、荧光竞争结合以及免疫定位研究,为西花蓟马更多嗅觉相关蛋白基因的发掘奠定基础,同时为阐明西花蓟马行为反应本质、与环境间的化学通讯提供理论依据。1.西花蓟马感器扫描电镜观察西花蓟马触角中的感器主要有毛形感器(sensilla trichodea)、刺形感器(sensilla chaetica)、锥形感器(sensilla basiconica)、乳状感器(mamillary sensilla);足上主要有毛形感器、刺形感器、锥形感器、吸耳球形感器(sensilla ear washing buob-shaped)、乳突感器(mamillary sensilla)、钟形感器(sensilla campaniform)、B?hm氏鬃毛(B?hm bristle);复眼上只有1种刺形感器。2.西花蓟马嗅觉相关蛋白基因分子克隆成功克隆获得4个西花蓟马嗅觉相关蛋白基因c DNA序列全长和1个基因c DNA序列片段,分别命名为Focc CSP1、Focc CSP2、Focc OBP1、Focc OBP2、Focc OR1,Gen Bank登录号分别为KM527949、KM035415、KM527948、KM527950、KM527951。Focc CSP1、Focc CSP2、Focc OBP1、Focc OR1全长c DNA序列分别为597bp、521bp、660bp、1645bp,开放阅读框分别为288bp、387bp、450bp、1374bp,分别编码95、128、149、457个氨基酸,预测成熟蛋白分子量分别为11.377、14.51、16.388、51.19k Da,等电点分别为4.72、5.41、7.46、5.08,Focc CSP2和Focc OBP1的N-端分别含有19、22个氨基酸组成的信号肽。获得Focc OBP2的c DNA序列880bp,通过生物学分析发现具有完整的开放阅读框,ORF长591bp,编码196个氨基酸,预测该成熟蛋白分子量为23.66k Da,等电点为7.41。3.西花蓟马嗅觉相关蛋白基因表达谱分析各基因在西花蓟马不同发育期的表达丰度差异较大,Focc CSP1在羽化1 d雌虫中的相对表达量最高,其次为2龄若虫;Focc CSP2在1龄若虫中的相对表达量最高,其次为羽化1天的雌虫;Focc OBP1在2龄若虫和1龄若虫中的相对表达量最高,其次为羽化1天的雌、雄成虫;Focc OBP2在2龄若虫中的相对表达量最高,其次为羽化1天的雌、雄成虫;Focc OR1在羽化1 d雌虫中的相对表达量最高,其次为2龄若虫、羽化1 d的雄虫。各基因均在触角中的表达量最高,Focc CSP1、Focc CSP2和Focc OR1均在触角中的相对表达量最高,其次为足;Focc OBP1基本上是在触角中特异性表达,在足、头、胸等部位该基因表达甚微;Focc OBP2在触角中表达量最高,在足部该基因也有少量表达。4.西花蓟马嗅觉相关蛋白的原核表达与纯化成功构建了重组表达质粒p ET-30a(+)/Focc CSP1、p ET-30a(+)/CSP2、p ET-30a(+)/OR1,经诱导表达及Ni柱纯化,成功获得不带融合标签的目的蛋白Focc CSP1和Focc CSP2,分子量分别约为11 k Da和15 k Da,采用BCA蛋白浓度测定法测定了纯化后目的蛋白的浓度,Focc CSP1蛋白浓度为1.455 mg/m L,Focc CSP2蛋白浓度为1.013 mg/m L,满足后续试验的需要。5.西花蓟马化学感受蛋白Focc CSP2结合特性选用19种化学气味分子作为配基测试了西花蓟马化学感受蛋白Focc CSP2的与各气味分子的结合能力,以1-NPN作为荧光报告子,结合能力最强的是茴香醛,[IC50]值为11.3944μmol/L,与Focc CSP2的竞争结合常数KD为10.5047;其次为香叶醇,[IC50]值为15.3463μmol/L,KD为14.1480。相对结合能力中等有甲基水杨酸、烟酸乙酯、异烟酸甲酯、苯甲醛、乙基苯、香茅醇、香茅醛、正壬醛、芳樟醇,[IC50]从35.2426μmol/L逐渐上升到85.6408μmol/L,KD也从32.4906增加到78.9534。其余气味物质的相对结合能力较弱。6.西花蓟马化学感受蛋白Focc CSP1免疫电镜定位通过免疫新西兰大白兔制备了Focc CSP1蛋白抗体,透射电镜观察显示,该蛋白抗体具有较强的免疫特异性,能与该蛋白很好的结合,并确切的反应出该蛋白的分布。胶体金颗粒在西花蓟马触角、感器、头、足等部位淋巴液中都明显标记,可见该蛋白基因组织分布广泛,与该基因基于q RT-PCR表达谱检测结果吻合。推测该基因除了参与环境气味物质的识别、运输外,还可能参与感受机械刺激、调节生长发育或其它重要的生理功能。
【关键词】：西花蓟马 嗅觉相关蛋白 分子克隆 原核表达 表达谱 荧光竞争结合 免疫定位
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S433.89
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-14
• 英文缩略表14-15
• 第一章 引言15-24
• 1.1 昆虫气味结合蛋白16-20
• 1.1.1 气味结合蛋白的种类17
• 1.1.2 气味结合蛋白OBPs的表达分布17-18
• 1.1.3 气味结合蛋白OBPs的三维结构研究18-19
• 1.1.4 气味结合蛋白OBPs的功能研究19-20
• 1.2 化学感受蛋白CSPS研究进展20-21
• 1.2.1 昆虫化学感受蛋白序列基本特征20
• 1.2.2 已鉴定的昆虫化学感受蛋白20
• 1.2.3 昆虫化学感受蛋白的分布20-21
• 1.2.4 昆虫CSPs的功能21
• 1.3 嗅觉受体研究进展21-22
• 1.4 研究思路及意义22-23
• 1.5 技术路线23-24
• 第二章 西花蓟马感器扫描电镜观察24-33
• 2.1 材料与方法24-25
• 2.1.1 供试昆虫24
• 2.1.2 仪器24
• 2.1.3 试验方法24-25
• 2.2 结果与分析25-31
• 2.2.1 西花蓟马触角基本形态特征25
• 2.2.2 西花蓟马触角感器类型、特征及分布25-28
• 2.2.3 西花蓟马足感器类型、特征及分布28-31
• 2.2.4 西花蓟马复眼感器类型、特征及分布31
• 2.3 讨论31-33
• 第三章 西花蓟马嗅觉相关蛋白基因分子克隆33-84
• 3.1 材料与方法33-46
• 3.1.1 供试昆虫33
• 3.1.2 主要试剂33-34
• 3.1.3 仪器设备34
• 3.1.4 主要缓冲液和培养基的配方34-35
• 3.1.5 试验方法35-45
• 3.1.6 西花蓟马嗅觉相关蛋白基因的鉴定45
• 3.1.7 序列分析和进化树构建45-46
• 3.2 结果与分析46-83
• 3.2.1 西花蓟马触角总RNA提取46
• 3.2.2 西花蓟马嗅觉相关基因特异性片段扩增46-48
• 3.2.3 西花蓟马嗅觉相关蛋白基因 3′-RACE48-49
• 3.2.4 西花蓟马嗅觉相关蛋白基因 5′-RACE49-51
• 3.2.5 目的基因全长cDNA序列的获取51
• 3.2.6 西花蓟马FoccCSP1蛋白基因基本理化性质51-56
• 3.2.7 西花蓟马FoccCSP2蛋白基本理化性质56-63
• 3.2.8 西花蓟马FoccOBP1蛋白基本理化性质63-71
• 3.2.9 西花蓟马FoccOBP2蛋白基本理化性质71-74
• 3.2.10 西花蓟马FoccOR1蛋白基本理化性质74-83
• 3.3 讨论83-84
• 第四章 西花蓟马嗅觉相关蛋白基因表达谱分析84-95
• 4.1 材料和方法84-86
• 4.1.1 供试昆虫84
• 4.1.2 试剂84
• 4.1.3 仪器设备84
• 4.1.4 RNA的提取84-85
• 4.1.5 第一链cDNA的合成85
• 4.1.6 Real-time qPCR85-86
• 4.2 结果与分析86-93
• 4.2.1 FoccCSP1表达谱分析86-88
• 4.2.2 FoccCSP2表达谱分析88-89
• 4.2.3 FoccOBP1表达谱分析89-90
• 4.2.4 FoccOBP2表达谱分析90-92
• 4.2.5 FoccOR1表达谱分析92-93
• 4.3 讨论93-95
• 第五章 西花蓟马嗅觉相关蛋白的原核表达与纯化95-118
• 5.1 材料与方法95-106
• 5.1.1 供试昆虫95
• 5.1.2 主要试剂95
• 5.1.3 主要仪器设备95-96
• 5.1.4 聚丙烯酰胺凝胶及电泳缓冲液的配制96-98
• 5.1.5 试验方法98-106
• 5.2 结果与分析106-117
• 5.2.1 开放阅读框扩增106-107
• 5.2.2 重组克隆质粒构建107-109
• 5.2.3 重组表达质粒的鉴定109-110
• 5.2.4 重组蛋白在大肠杆菌中的诱导表达110-112
• 5.2.5 重组蛋白western杂交112-113
• 5.2.6 分离重组蛋白113-115
• 5.2.7 纯化重组蛋白115-116
• 5.2.8 目的蛋白浓度测定116-117
• 5.3 讨论117-118
• 第六章 西花蓟马化学感受蛋白FOCCCSP2结合特性118-126
• 6.1 材料和方法118-120
• 6.1.1 试剂118
• 6.1.2 仪器118-120
• 6.2 结果与分析120-125
• 6.2.1 西花蓟马化学感受蛋白FoccCSP2与 1-NPN报告子的荧光光谱分析120-122
• 6.2.2 不同气味物质与 1-NPN和重组FoccCSP2蛋白的竞争结合分析122-125
• 6.3 讨论125-126
• 第七章 西花蓟马化学感受蛋白FOCCCSP1免疫电镜定位126-133
• 7.1 材料与方法126-128
• 7.1.1 试剂126
• 7.1.2 仪器126
• 7.1.3 缓冲液配方126-127
• 7.1.4 试验方法127-128
• 7.2 结果与分析128-132
• 7.2.1 抗体最佳稀释浓度的确定128-130
• 7.2.2 西花蓟马化学感受蛋白FoccCSP1免疫定位130-132
• 7.3 讨论132-133
• 第八章 全文结论133-135
• 参考文献135-154
• 致谢154-155
• 作者简历155

【参考文献】

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本文编号：987881