马铃薯干旱相关microRNA的鉴定及功能研究
发布时间：2017-10-07 00:00
本文关键词：马铃薯干旱相关microRNA的鉴定及功能研究
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【摘要】：马铃薯是继水稻、小麦和玉米之后的第四大主粮作物。它兼具蔬菜、粮食、饲料以及工业加工原料等多种用途,在满足人民生活和经济发展方面起着至关重要的作用。然而干旱胁迫严重影响其生长发育品质以及产量,是限制马铃薯生产最主要的非生物胁迫因素之一。植物对干旱胁迫的响应主要是通过调控相关基因的表达产生一系列生理生化反应来实现。到目前为止,大量干旱相关基因在转录水平已被鉴定出来。但对其转录后水平调控研究的报道较少。MicroRNAs是一类重要的非编码单链小分子RNA,通常在转录后水平调节基因的表达。研究发现,其调控的靶基因参与植物的生长发育和对各种非生物胁迫的响应,并且越来越多的miRNA功能相继被鉴定出来。但这些研究主要集中在拟南芥、水稻等模式植物中,对马铃薯干旱相关miRNA及其靶基因的研究报道较少。本研究利用序列同源比对以及miRNA二级结构分析,在马铃薯中鉴定出3个miR159和4个miR169家族新成员以及马铃薯中可能参与调控干旱胁迫下脯氨酸积累代谢的miRNAs。并且通过构建马铃薯耐旱型品种紫花白和干旱敏感型品种大西洋干旱处理和对照4个样品小RNA文库并测序,获得了大量旱相关的miRNAs。通过构建了马铃薯混合降解组文库并测序,以及降解位点进行了分析,验证了部分miRNA的靶基因,并对部分干旱相关重要靶基因的切割位点进行了5'-RLM-RACE验证。本研究获得的主要结果如下:1.基于植物miR159/169家族成员分别调控MYB和NF-YA类转录因子调控模式的保守性。本研究通过生物信息学分析在马铃薯中预测出3个miR159家族成员和4个miR169家族新成员。并通过靶基因预测,发现miR159可能调控R2R3型MYB转录因子家族成员,miR169可能调控NF-YA转录因子家族成员。并通过对miR159/169s和其预测靶基因的表达分析,发现在干旱胁迫下miR159/169s与其靶基因的表达模式呈负相关。因此,我们推断在干旱胁迫下,miR159/MYB和miR169/NF-YA的调控模式在马铃薯中也保守。2.为了研究miRNA是否参与干旱胁迫下脯氨酸积累代谢的调控。本研究以脯氨酸代谢相关酶基因mRNA序列作为潜在的miRNA靶基因序列与miRBase中已知植物的miRNA进行比对,并获得大量候选mi RNAs,经过一系列的筛选和生物信息学分析,共获得6个miRNA家族的11个miRNAs可能与马铃薯干旱胁迫下脯氨酸积累代谢的调控有关。结合定量PCR检测和调控机理分析,最终获得6个miRNA可能参与马铃薯干旱胁迫下脯氨酸积累代谢的调控。分别为miR172miR396cmiR396a和miR4233可能调节脯氨酸代谢酶P5CS基因,miR2673可能调节脯氨酸代谢酶P5CR基因,miR6461可能调节脯氨酸代谢酶ProDH基因。这一研究结果可以帮助我们很好的了解干旱胁迫下miRNA参与调控脯氨酸积累代谢的分子机理。3.为了在马铃薯全基因组水平筛选干旱相关的miRNAs,本研究通过构建马铃薯耐旱型品种紫花白和干旱敏感型品种大西洋干旱处理和对照4个样品小RNA文库并进行sRNA高通量测序。通过将测序结果与miRNAbase比对以及一系列生物信息学分析。最终在4个样本中共鉴定出1,338个miRNA,其中59为马铃薯已知的miRNA,1,279个为马铃薯新预测的miRNA;并对这些miRNA进行干旱胁迫下差异表达分析,结果表明在马铃薯干旱敏感型品种大西洋中有318个miRNA在干旱处理前后差异表达,在马铃薯耐旱型品种紫花白中有89个miRNA在干旱处理前后差异表达,并通过靶基因预测获得大量差异表达mi RNA的靶基因。4.miRNA功能研究的关键是鉴定其调控的靶基因。本研究为了更好的阐述差异表达miRNA参与干旱胁迫调控的分子机理,通过构建马铃薯混合降解组文库并测序,在马铃薯中共检测到84个靶基因的90个降解位点发生降解。通过对靶基因的功能注释,最终鉴定出12个mi RNA靶基因与干旱相关,其中7个mi RNA靶基因获得了5'-RLM-RACE验证。这些靶基因包括一些干旱相关的功能蛋白(抗坏血酸过氧化物酶,谷胱甘肽S转移酶和泛素结合酶),信号传导的激酶(丝氨酸/苏氨酸激酶)和转录因子(HD-Zip类转录因子,SPL类转录因子,NAC类转录因子和锌指结构类转录因子)。荧光定量PCR表达分析表明,这些miRNA的表达量在马铃薯耐旱型品种紫花白或干旱敏感型品种大西洋干旱处理前后存在明显的差异。以上结果表明:miRNA在马铃薯干旱胁迫的响应过程中起着重要的调控作用。
【关键词】：马铃薯 MicroRNA 干旱胁迫 高通量测序 差异性分析
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S532
【目录】：
- 摘要2-4
- SUMMARY4-6
- 缩略语表6-12
- 第一章 文献综述12-30
- 1.1 植物抗旱性机制概述12-18
- 1.1.1 植物抗旱的生理机制12-13
- 1.1.2 植物抗旱的分子机理13-17
- 1.1.2.1 功能基因14-16
- 1.1.2.1.1 渗透调节剂生物合成基因14-15
- 1.1.2.1.2 细胞抗氧化系统相关基因15-16
- 1.1.2.1.3 植物水通道蛋白基因16
- 1.1.2.1.4 蛋白酶类基因16
- 1.1.2.2 调节基因16-17
- 1.1.2.2.1 信号转导相关基因16-17
- 1.1.2.2.2 转录因子类基因17
- 1.1.3 马铃薯的抗旱性研究17-18
- 1.2 MIRNA的概况和研究进展18-28
- 1.2.1 miRNA的发现18
- 1.2.2 植物miRNA的生物合成及作用方式18-19
- 1.2.3 植物miRNA的分离鉴定19-20
- 1.2.3.1 直接克隆分离法19
- 1.2.3.2 正向遗传学鉴定法19-20
- 1.2.3.3 生物信息学的方法鉴定20
- 1.2.3.4 基因芯片鉴定法20
- 1.2.4 miRNA与植物的生长发育20-22
- 1.2.4.1 miRNA参与调控植物开花及花器官发育20-21
- 1.2.4.2 miRNA参与调控植物叶片发育21
- 1.2.4.3 miRNA参与调控植物器官形变21-22
- 1.2.4.4 miRNA参与调控植物激素信号的传导22
- 1.2.5 miRNA参与自身的反馈调节22-23
- 1.2.6 miRNA与植物的养分胁迫23-25
- 1.2.6.1 miRNA与低磷胁迫23-24
- 1.2.6.2 miRNA与氮胁迫24
- 1.2.6.3 miRNA与硫胁迫24-25
- 1.2.6.4 miRNA与微量元素胁迫25
- 1.2.7 miRNA与植物的氧化胁迫25-26
- 1.2.8 miRNA与植物的低温胁迫26
- 1.2.9 miRNA与植物的盐胁迫26-27
- 1.2.10 miRNA与植物干旱胁迫27-28
- 1.3 本研究的目的和意义28-30
- 第二章 马铃薯MIR159/169及其靶基因的预测及表达分析30-52
- 2.1 实验材料30-31
- 2.1.1 植物材料30
- 2.1.2 数据来源30-31
- 2.1.3 分析软件31
- 2.2 实验方法31-37
- 2.2.1 马铃薯miR159/169的预测31-32
- 2.2.2 实验材料的生长及干旱处理32
- 2.2.3 RNA的提取及检测32-33
- 2.2.4 Stu-miR159/169s靶基因的预测及功能分析33-34
- 2.2.5 靶基因序列的生物信息学分析34
- 2.2.6 Stu-miR159/169s成熟序列的qRT-PCR表达分析34-36
- 2.2.7 预测靶基因的荧光定量PCR验证36-37
- 2.3 实验结果37-48
- 2.3.1 马铃薯中miR159/169家族成员的预测37-40
- 2.3.2 miR159/169靶基因的鉴定及克隆40-43
- 2.3.3 靶基因的进化树分析43-46
- 2.3.4 靶基因的基因结构分析46
- 2.3.5 miR159/169通过调控MYB和NF-YA转录因子来响应干旱胁迫46-48
- 2.4 讨论48-52
- 2.4.1 miR159/169在马铃薯中也保守存在49-50
- 2.4.2 马铃薯miR159/169通过调控转录因子MYB和NF-YA来响应干旱胁迫50-52
- 第三章 马铃薯干旱胁迫下脯氨酸代谢相关MIRNAS的鉴定52-63
- 3.1 实验材料52-53
- 3.1.1 植物材料52
- 3.1.2 数据来源52-53
- 3.2 实验方法53-55
- 3.2.1 实验流程图53
- 3.2.2 材料处理53-54
- 3.2.3 脯氨酸含量的测定54
- 3.2.4 以P5CS, P5CR和ProDH基因mRNA序列预测miRNA54
- 3.2.5 保守miRNAs在马铃薯中的计算机预测54
- 3.2.6 获得miRNAs的表达分析54-55
- 3.3 实验结果55-60
- 3.3.1 干旱胁迫下脯氨酸含量的变化55
- 3.3.2 预测可能调控脯氨酸代谢的miRNAs55-59
- 3.3.3 QRT-PCR表达分析筛选调控马铃薯脯氨酸代谢相关的miRNAs59-60
- 3.4 讨论60-63
- 3.4.1 马铃薯不同品种抗旱性与脯氨酸积累的关系60-61
- 3.4.2 MiRNA可能参与干旱胁迫下脯氨酸的积累的调控61-63
- 第四章马铃薯不同耐旱型品种干旱相关的miRNAs的鉴定63-95
- 4.1 实验材料63-64
- 4.1.1 植物材料63
- 4.1.2 数据库及软件63
- 4.1.3 主要仪器63-64
- 4.2 实验方法64-69
- 4.2.1 材料处理64
- 4.2.2 RNA的提取及检测64-65
- 4.2.3 小RNA文库的构建及测序65-66
- 4.2.4 测序数据的基本分析66-67
- 4.2.5 miRNA的鉴定67-68
- 4.2.5.1 长度的分类统计67
- 4.2.5.2 碱基偏向性分析67
- 4.2.5.3 已知的miRNAs的鉴定67
- 4.2.5.4 新miRNA的预测67-68
- 4.2.6 miRNA的差异分析68
- 4.2.7 miRNA靶基因的预测68-69
- 4.2.8 预测靶基因的功能注释69
- 4.3 结果与分析69-93
- 4.3.1 测序数据的统计与分析69
- 4.3.2 sRNA的Rfam注释69-71
- 4.3.3 样品间small RNA公共及特有序列分析71-74
- 4.3.4 sRNA长度统计74-79
- 4.3.5 miRNA成熟序列的碱基偏好性分析79-80
- 4.3.6 已知miRNA的鉴定80-81
- 4.3.7 四个样品中新预测的miRNAs81-84
- 4.3.8 miRNA靶基因的预测84-85
- 4.3.9 miRNA的差异表达分析85-90
- 4.3.9.1 差异表达miRNA的维恩图86
- 4.3.9.2 差异表达miRNA的聚类分析86-90
- 4.3.10靶基因的功能注释90-93
- 4.3.10.1 所有靶基因的注释90
- 4.3.10.2 差异表达miRNA靶基因的注释90
- 4.3.10.3 差异表达miRNA靶基因的GO分类90-91
- 4.3.10.4 差异miRNA靶基因的COG注释91-92
- 4.3.10.5 差异miRNA靶基因的KEGG通路富集分析92-93
- 4.4 讨论93-95
- 4.4.1 sRNA高通量测序对样品RNA质量的要求93-94
- 4.4.2 高通量测序对新miRNA的鉴定及差异表达miRNA筛选的有效性94-95
- 第五章 马铃薯miRNA的靶基因的鉴定95-120
- 5.1 实验材料95-96
- 5.1.1 植物材料95
- 5.1.2 软件及数据库95-96
- 5.2 实验方法96-101
- 5.2.0 材料处理96
- 5.2.1 RNA 的提取及检测96
- 5.2.2 转录组文库的构建及测序96-97
- 5.2.3 降解组测序数据的分析97
- 5.2.4 马铃薯干旱相关miRNA及其靶基因的鉴定97
- 5.2.5 干旱相关miRNA靶基因的RLM-5'RACE验证97-100
- 5.2.5.1 5'端接头的连接97-98
- 5.2.5.2 反转录合成cDNA第一链98
- 5.2.5.3 巢式PCR反应扩增98-100
- 5.2.5.4 目的片段与T载体的连接100
- 5.2.5.5 连接产物的转化及测序100
- 5.2.6 干旱相关miRNA的qRT-PCR验证100-101
- 5.3 结果与分析101-113
- 5.3.1 基础分析101-103
- 5.3.1.1 测序数据统计101-102
- 5.3.1.2 非编码RNA注释102-103
- 5.3.2 降解位点分析103-106
- 5.3.3 马铃薯干旱相关miRNA靶基因的 5’RACE验证106-110
- 5.3.4 马铃薯干旱相关miRNA的荧光定量分析110-113
- 5.4 讨论113-120
- 5.4.1 降解组测序鉴定马铃薯miRNA靶基因的有效性113-114
- 5.4.2 MiRNA参与调控马铃薯对干旱胁迫的响应114-119
- 5.4.3 后期的实验安排119-120
- 结论120-121
- 参考文献121-138
- 致谢138-139
- 作者简介139-140
- 导师简介140-141
- 附录141-204
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前2条
1 曹雪;上官凌飞;于华平;杨光;王晨;谭洪花;房经贵;;葡萄SBP基因家族生物信息学分析[J];基因组学与应用生物学;2010年04期
2 戴高兴;彭克勤;萧浪涛;邓国富;;聚乙二醇模拟干旱对耐低钾水稻幼苗丙二醛、脯氨酸含量和超氧化物歧化酶活性的影响[J];中国水稻科学;2006年05期
，本文编号：985729
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