唾液酸的饮食干预对仔猪齿状回神经细胞及海马BDNF含量的影响

【摘要】 研究背景：N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)和N-羟基神经氨酸(Neu5Gc)是哺乳动物中最常见的唾液酸,但人类在进化过程中由于CMAH基因的突变,自身只能合成Neu5Ac。Neu5Ac是母乳中的重要成分,同时也是大脑中神经节苷脂的构成组分,在人体中,脑组织中唾液酸的含量最高,婴幼儿主要通过母乳摄入Neu5Ac以维持脑发育。记忆力作为神经系统功能之一,表现在对外界刺激的反应程度和神经冲动的传导速度。这种信息传递以及神经冲动的传导必须通过突触来实现,可见稳定的突触连接是记忆力形成的结构基础,多项研究证实唾液酸是作用于大脑细胞膜及突触的营养素,并且在神经系统中担负着特殊的使命,可促进神经细胞的分化、发育和神经再生的作用,参与突触传递、维持细胞的正常机能,参与学习与记忆的过程。因此,摄入足够的唾液酸对于婴儿脑功能的正常发育尤其重要。在一项对于母乳喂养儿和人工喂养儿的比较研究中发现,母乳喂养儿唾液中唾液酸的含量比人工喂养儿高。近年来,唾液酸对于婴幼儿脑发育的重要生理作用受到越来越多的关注,但是相关的基础研究多限制在啮齿类动物体内进行。本谍题的创新之处在于采用与人类脑发育过程相似的仔猪模型,研究唾液酸的摄入对仔猪学习和认知的影响,并探索其背后可能的分子机制,为唾液酸的营养功能提供进一步的科学依据。研究目的：通过测量38日龄仔猪海马神经细胞的分布及数目,来探索唾液酸摄入对神经细胞的影响；通过测量38日龄仔猪海马脑源性神经营养因子(BDNF)的表达,检测唾液酸对BDNF含量的影响。研究方法：本实验将29只3日龄雄性仔猪随机分为对照组(n=15)和唾液酸处理组(n=14),并以配方奶连续喂养35天。其中对照组的唾液酸为奶粉中原有量,未额外添加,唾液酸的含量为Neu5Ac:77.7±1.6mg/100g奶粉；处理组唾液酸的含量为Neu5Ac:486.8±35.2mg/100g奶粉。仔猪于39口龄时麻醉处死取材,采用免疫荧光方法研究唾液酸摄入对海马神经细胞可塑性、成熟神经细胞、神经胶质细胞(星形胶质细胞)和增殖细胞分布与表达的影响,并采用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测两组仔猪海马中BDNF含量,从而推测唾液酸对仔猪海马BDNF的影响。研究结果：(1)膳食添加唾液酸对仔猪体重和脑重无明显影响；(2)处理组海马齿状回中多聚唾液酸(PolySia-NCAM)的表达量比对照组有所增加,但差异无统计学意义；(3)神经元特异性核蛋白(NeuN)主要在齿状回的颗粒细胞、Hillus区、阿蒙角的椎体细胞层中表达,处理组与对照组的NeuN阳性细胞个数差异无统计学意义,提示唾液酸的摄入对成熟神经元的数口无显著影响；(4)胶质纤维酸性蛋白(GFAP)在齿状回的表达分布与PolySia-NCAM分布呈现协同的趋势,主要存在于颗粒细胞层中,由此可见PolySia-NCAM在星形胶质细胞的细胞膜上有表达。比较不同组间齿状回GFAP与PolySia-NCAM的荧光强度(IOD/Area),两组的差异无统计学意义,但是处理组有增高的趋势；(5)Ki-67标记的新生细胞主要位于仔猪齿状回颗粒细胞下层,对38日龄仔猪Ki-67阳性细胞计数的结果显示处理组与对照组差异无统计学意义；(6)采用ELISA方法测定仔猪海马组织中BDNF含量,处理组的含量相对于对照组有增高的趋势,但结果差异无统计学意义。结论：唾液乳糖的摄入对仔猪海马齿状回成熟神经元、新生细胞的数目无显著影响,但可能通过增加齿状回的可塑性及星形胶质细胞、增加BDNF的含量,进而影响学习与记忆的通路。 

1.前言

1.1唾液酸
唾液酸是一类天然糖类化合物，最早由Blix等[4]从牛下颂唾液腺粘蛋白中分离得到，因此命名为唾液酸。后来的研究表明它的结构是0，N-二乙酰神经氨酸[5]，Klenk等将其命名为神经节苷脂（Ganglioside)[6]，继续分离纯化出结晶后为多轻基氨酸，并命名为神经氨酸（Neuraminic acid),现已分析出该组分为脱乙酰唾液酸甲醇酯。唾液酸类化合物是以九碳糖神经氨酸(5-amino-3,5-dideoxy-D-glycero-D-galactononulsonic acid)为基本结构的一族衍生物的总称，目前已发现50多种天然存在的唾液酸，其中N-乙酰神经氨酸（2-keto-S-acetamido-SjSdideoxy-D-glycero-D-galactononulsonic acid，Neu5Ac， NANA,图1.1.1.1 A)是人体中最常见的存在形式⑴。当N-乙酷基被轻化之后生成N-轻基乙酰神经氧酸（N-glycolylneuratninic acid, NeuSGc,图 1.1.1.1 B)，存在于除人类之外的哺乳动物，如马、牛、大獲獲等。1988年Inoue等人在精液和鲑鱼卵中发现C5氨基被经基取代的另一种唾液酸形式脱氨基神经氨酸（ketodeoxynonulosonic acid, KDN,图 1.1.1.1 C)。

1.2学习与记忆
由于判断标准不同，记忆的分类至今仍然在神经科学领域里存在很大争议。记忆的分类方法较多，根据记忆的时程可将其分为短时记忆（short-term memory, STM)和长时程记忆（long-term memory,LTM),短时记忆-I般持续几秒到几小时，且易于破坏，而长吋程记忆是指经过几天、几月甚至几年仍然能再现的记忆根据信息的储存和再现方式可分为陈述性记忆（declarative memory)和非陈述性记忆（non-declarative memory)。前者是对事实、事件以及它们之问相互关系的记忆,可以通过有意识的回忆获取，例如用语言描述被记忆的内容，后者需耍有意识的回忆就能获取，包括程序性记忆（技巧或习惯的记忆）、启动效应（如辨认曾经经历过的刺激）、联合型学习(条件反射）和非联合型学习（习惯化和敏感化）[64]。学习与记忆密不可分，它们共同改变着大脑内神经元群的活动。其生理机制一直是现在神经科学的研究重点和热点。
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2.材料与方法

2.1实验仪器
冷冻切片机 美国Leica，CM1900
焚光显微镜 尼康，80i
共聚焦显微镜 日本奥林巴斯，
FV1000低速离心机 上海安亭科学仪器
超低温冰箱 海尔全自动酶标仪 
Thermo，Varioskan FlashPAP免疫组化笔 福州迈新生物有限公司

2.2实验试剂
戊巴比妥钠 Sigma
PBS缓冲液 武汉博士德生物有限公司，
AR0030
NeuN 抗体 Novus Biologicals，NBP1-92716
GFAP 抗体 Abcam，bl04455
PolySia-NCAM 抗体 Millipore，MAB5324
Ki-67 抗体 Millipore，AB9260
牛血清白蛋白 北京元亨圣马生物技术
OCT 组织包埋胶 SakuraFinetek，4583
山羊抗小鼠（Alexa Fluo 488) Jackson ImmunoResearch，115-545-146

2.材料訪法 ..............22
2.1实验仪器 ...............22
2.2实验试剂...................... 22
3.结果.........................28 
3.1唾液酸对仔猪体重与脑重的影响............ 28
3.1.1唾液酸摄入对仔猪体重的影响 .............28
3.1.2唾液酸摄入别仔猪脑重的影响................... 30 
4.讨论........42 
4.1唾液酸的摄入对仔猪体重及脑重的影响 ..............42
4.2唾液酸对仔猪海马BDNF表达水平的影响 ............................42

3.结果

3.1唾液酸对仔猪体重与脑重的影响
3日龄雄性仔猪从猪场运回实验室，平均体重2.27±0.1kg，饲养至38曰龄后平均体重达9.25±0.39 kg，组间平均体重均无显著性差异（P>0.05)。仔猪每日的体重记录如表3.1.1，饲养初期仔猪可能因为饮食的突然改变（母乳转变为配方奶）出现吐奶、厌奶及腹湾的现象，因而第一周仔猪的体重增长趋势缓慢，每曰平均增长0.046kg,第二周逐渐适应配方奶，体重增长速度加快，每日平均增长0.104kg，之后仔猪体重呈正常的指数性生长，增长趋势如图3.1.1所示。我们的研究结果显示，唾液酸对仔猪体重无明显的影响，差异没有统计学意义（P>0.05，T 检验）。
39日龄时对仔猪注射致死剂量的戊巴比妥钠（lOOmg/kg，Sigma公司），取脑后称全脑重量，平均脑重55.98 ± 0.82 g，平均脑体比为6.29 ± 0.23 g脑重/kg体重，两组间的脑重与脑体比接近，差异无统计学意义（T检验，P>0.05)。

3.2唾液酸的摄入对仔猪海马BDNF水平的影响
釆用ELISA方法测定仔猪海马组织中BDNF含量，BCA蛋白浓度标准曲线如图3.2.1，BDNF标准曲线如图3.2.2，根据标准曲线计算得出的结果显示（图3.2.3),对照组仔猪海马组织中BDNF的含量为51.95 pg/mg protein，唾液酸处理组为53.40 pg/mg protein，差异无统计学意义（两独立样本T检验，P=0.902)。
多聚唾液酸（Polysialic acid)己被证实与祌经细胞的发育及突触可塑性等息息相关，在早期发育阶段的未成熟神经细胞中广泛表达，并随着分化过程而慢慢减少，已有相关研究报道，脑组织中的海马齿状回颗粒下区（subgranular zone,SGZ)与室管膜下区（subventricu丨arzone, SVZ)终生具备神经发生的能力。本实验我们采用免疫荧光方法检测仔猪海马内多聚唾液酸在不同组间的表达差异。图3.3.1劳光结果显示，与先前在哨?类动物体内的研究描述相同，在海马齿状回（Dentate gyms, DG)的颗粒细胞(Granular cell layer, Gr)、阿蒙角（Comuammonis, CA)的椎体细胞层（pyramidale layer, Py)均有 PolySia-NCAM 的表达，在齿状回的分了-)5?达相对较弱且分散,阿蒙角的分了未见有阳性表达。各区域的表达如图3.2.2。比较不同组间PolySia-NCAM的焚光强度（lOD/Area)如图3.3.3，处理组PolySia-NCAM的表达相对于对照组有增高的趋势，但差异无统计学意义(P〉0.05，T test)。

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4.讨论

大脑发育最快也最关键的时期是出牛.前出生后早期，此时营养的摄入、吸收和转化利用将对大脑的成熟有至关重耍的影响，如果此时营养摄入+足将会导致不可逆转的远期不良后果。目前为止，相关研究尚未深入，而且唾液酸对中枢神经系统的结构与功能的影响以及它在影响学习与记忆过程中存在的分子机制仍未彻底祸示。此外相关研究多在喷齿类动物（如大鼠、小鼠）上进行，木研究则采用与人类在生理、解剖、脑发育等更接近的仔猪模型分别研究唾液酸的摄入对神经细胞可塑性、成熟神经元、神经胶质细胞（星形胶质细胞）和增殖细胞的影响，以及对海马BDNF蛋白表达的影响。

4.1唾液黢的摄入对仔猪体重及脑重的影响
通过记录仔猪每口体重变化，可知其生长趋势正常，组间平均体重无显著性差异，仔猪39日龄处死时称量脑重的结果显示组问无统计学差异，说明两组仔猪发育基本正常，发育程度也相似无较大差别，提示膳食添加唾液酸对仔猪体重和脑?无明显影响。

4.2唾液酸对仔猪海马BDNF水平的影响
近年来，对学习与记忆机制的研究很多集中在神经营养因子及其信号通路，这些神经营养因子包括BDNF、神经生长因子（Neuron Growth Factor, NGF)和神经营养因子-3 (Neurotrophin-3，NT-3),它们在脑组织巾广泛表达，影响神经元的结构与功能。其中BDNF足脑内分布最广的神经营养因子，尤其以大脑皮层和海马中含量最高，对神经元的存活、突触传递和突触重塑有重要的调节功能。已有研究发现，在未成熟神经元，BDNF及其受体TrkB调控祌经元的增生神经前体细胞和新生神经元的分化成熟和生存等77]，还可促进神经元的再生[78]，调控海马的可塑性。

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参考文献:

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• [5] 张培.  浆水制备工艺和营养成分分析方法的研究[D]. 兰州大学 2014
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• [7] 徐月敏.  鱼皮低聚肽和鹿血低聚肽抗氧化活性研究[D]. 兰州大学 2014
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