论文检索
论文发表
当前位置：主页 > 硕博论文 > 社科硕士论文 >

荧光PCR熔解曲线法快速诊断耐药结核病的临床应用评估

发布时间：2014-09-20 20:57

【摘要】 本文主要包含两个部分,第一部分建立了一种磁珠法提取结核分枝杆菌核酸的方法,并对其进行优化,证明了其有效性。第二部分通过检测临床标本,对荧光PCR熔解曲线法检测结核分枝杆菌耐药突变试剂盒进行了较全面的评估,阐述了该试剂盒在临床应用中的优缺点。结核分枝杆菌的细胞壁厚,难以破裂,同时,结核病患者的痰液中含有大量的呼吸道分泌物及粘蛋白等成分,这些因素对结核分枝杆菌核酸的提取带来了不利影响,直接影响了后续的快速诊断。我们建立了一种利用磁珠进行吸附的提取方法,通过加热和裂解液对结核分枝杆菌进行破壁,依靠磁珠对核酸的吸附能力,多次洗脱痰液中残留的抑制成分,最终得到质量较高的核酸。我们对提取过程中的加热时间,液化液用量以及裂解洗脱次数进行了优化,最终得到了较为完善的提取方案。通过模拟阳性痰液我们考察了该方法的灵敏度,结果显示,在200CFU/mL以上含量的痰液中提取的核酸都能有效的进行PCR扩增。我们还对140份临床标本进行了提取检测,其中85份镜检阳性标本中都能有效提取到核酸进行PCR扩增检测,灵敏度达到100%,镜检阴性痰中也有提取到,这可能是由于抗酸染色镜检的局限性以及PCR检测方法的特异性造成的。我们对200份临床标本进行了药物敏感性试验和四种(利福平、异烟肼、链霉素、乙胺丁醇)荧光PCR熔解曲线法检测试剂盒快速检测。对结果进行了一个对比,结果发现,利福平突变检测试剂盒的灵敏度为100%,特异性为97.8%；异烟肼突变检测试剂盒的灵敏度为94.4%,特异性为98.8%；链霉素突变检测试剂盒的灵敏度为85.3%,特异性为98.2%；乙胺丁醇突变检测试剂盒的灵敏度为90.9%,特异性为97.9%。表明四种试剂盒的特异性均较高,其中利福平突变检测试剂盒的灵敏度最高。该结果表明四种试剂盒在灵敏度和特异性方面具有较好的性能。我们还通过对605份临床标本的检测,从检测时间、检测水平、试剂盒稳定性、污染情况、不同仪器的对比、结果判读复杂性等多个方面对六种试剂盒进行了考察评估。从临床标本核酸的提取到完成六种药物突变检测,在2-3天内即可完成,与传统的药敏试验相比大大缩短了检测时间,这是荧光PCR熔解曲线法检测耐药情况具有的最大优势。我们对六种试剂盒的检测水平进行了考察,每种试剂盒的检测底线略有不同,其中氟喹诺酮突变检测的水平最强。我们对放置10天、一个月、二个月、三个月的试剂盒进行了评估,发现三个月内试剂盒检测性能变化不大,第三个月时开始出现小幅下降。在污染方面,六种试剂盒发挥了良好的性能,整个检测过程中只出现了3次污染,而传统培养和药敏试验有15次污染。在上述的评估中,试剂盒都发挥了其优秀的性能,但是,试剂盒在结果判读方面还有需要改进的地方,容易出现一些难以判定的结果,对结果判读人员的理论知识有一定的要求。综合多方面的评估结果,我们认为,荧光PCR熔解曲线法是简单快速、可靠实用的检测技术,基于该方法的试剂盒具有灵敏度高、特异性好、能有效避免污染的优良特点,具有较好的临床应用意义。 

【关键词】 熔解曲线法； 结核分枝杆菌； 评估； 

第一章绪论

1.1结核病概述
结核病是由结核分枝杆菌引起的慢性熏染性疾病，可累及满身各器官，最常见的抱病部位是肺部，重要通过呼吸道、消化道和皮肤等方法举行流传熏染。结核菌进入人体后被巨嗟细胞吞瞭，细菌在细胞内的存在和恒久存活引发的宿主免疫反响是影响发病、疾病历程和转归的决定用性因素。结核病的特性性病理转变是肉芽肿性病变和结核结节。其根本病理变革为排泄性病变、增素性病变和坏去世性（变质性）病变[1，2]。
结核病可以分为五大类:原发性肺结核、血行播散性肺结核、继发性肺结核、结核性胸膜炎、其他肺外结核。
..............................

1. 2结核病的流行
1.2.1国际情况
结核病是一种危害全人类的重大传染病，20世纪在全球范围内结核病经历了三次回升[4]，前两次与两次世界大战的爆发有直接原因，第三次的回升与人口流动、耐多药结核病的发生、HIV感染等有密切关系。目前，世界上所有的国家都处在结核病的威胁之下。1998年世界卫生组织对会员国进行了一次结核病疫情调查，结果显示，大多数发展中国家和部分发达国家疫情继续上升[5]，只有少数发达国家的结核病疫情能保持下降。全世界大约有1/3的人口感染了结核分枝杆菌，活动性结核病人达2000万，每年约有800-1000万新发结核病人[6]，近300万人死于结核病。
据世界卫生组织2010年全球结核病控制报告[7], 2009年全球约有940万例新发结核病患者（相当于每100, 000人中有137例患者），患者总人数每年都在轻微的上涨，其中妇女有330万，占总数的35%。940万新发结核病中有55%发生在亚洲，30%发生在非洲，7%发生在地中海东部，4%发生在欧洲，3%发生在美洲。
............................

第二章磁珠法提取结核分枝杆菌的核酸

第一节前言
目前，结核分枝杆菌核酸提取的方法有很多，包括酷氯仿抽提法、非有机溶剂提取法（盐析法）、固相吸附提取法等，在这些方法中，固相吸附法更简便和易于自动化，同时，因为没有有机溶剂的参与，不会有酷类物质残留，处理条件比较温和，对核酸的损伤较小。KathrynA等人对二氧化挂吸附材料做了大量研究，在pH较低的高离子缓冲液中，二氧化桂容易吸附带有负电荷的物质，而DNA的憐酸骨架带有负电荷，易被吸附，同时生成大量的水和离子，更驱使核酸集聚到二氧化桂的表面。结合缓冲液能使核酸构象发生改变，与二氧化娃表面形成氢键，被二氧化娃吸附。当二氧化娃所处的环境pH值升高后，以上的作用力正好相反，于是就从二氧化桂表面洗脱下来。正基于二氧化桂的这种优良特性，使其成为很好的固相吸附材料，本研宄就采用二氧化桂包被的磁珠进行核酸提取。
.........................

第二节材料和方法
2.1材料
主要仪器:
垂直超净工作台 厦门碧杭仪器有限公司
微量振荡器 德国IKA公司
1.5ml离心管台式高速离心机 厦门联仪通有限公司
罗氏LightCycler480 瑞士罗氏公司
移液枪 Eppendorf公司
恒温器 PeQLab公司
ND-1000微量紫外/可见分光光度计Thermo Fisher Scientific 美国
主要试剂：
痰液液化液：包含2%NaOH溶液；0.5%NALC (N-乙酰-L-半腕氨酸）溶液；1.45%梓檬酸钠溶液。
PBS 缓冲液（pH=6.8);
TE 溶液：DNA 提取液，包含 lOmMTris-HCl (pH=8.0)； ImMEDTA (乙二胺四乙酸）溶液；
TET 溶液：包含 lOmM Tris-HCl (pH=8.0)； ImM EDTA (乙二胺四乙酸）溶液；1%TX-100;
ImM DTT溶液：将0.27gDTT溶解于600 U L去离子水中。
Lab-Aid核酸（DNA)分离试剂盒（磁珠法)：厦门致善生物科技有限公司生产。
H37RV标准菌株灭活菌液：由深圳市慢性病防治中心提供。
标本：100份结核阴性痰标本，来源于厦门市中山医院呼吸科和实验室志愿者。主要用于核酸提取优化实验。140份（85份阳性55份阴性）痰标本，来源于厦门市疾病控制中心，主要用于提取方法的检验。
..............................

第三章 荧光PCR熔解曲线法快速诊断结核分枝杆菌耐药性的临床应用评价 .............40-67 
第一节 引言 ...............40-42 
第二节 材料和方法 ..............42-54 
3.1 材料 ................42-43 
3.1.1 主要器材 ............42 
3.1.2 主要试剂 ..............42-43 
3.2 方法 ...............43-54 
3.2.1 结核分枝杆菌核酸提取 ...............43-44 
3.2.2 MTBC快速检测 ..............44-45 
3.2.3 结核分枝杆菌耐药突变的快速检测 .............45-49 
3.2.4 结核分枝杆菌的分离培养 ............49-50 
3.2.5 结核分枝杆菌药敏试验 ..........50-51 
3.2.6 荧光PCR熔解曲线法快速检测与药敏试验对比试验 ...............51-52 
3.2.7 快速诊断试剂盒性能评价试验........... 52-54 
第三节 结果和结论 ............54-65 
3.3.1 荧光PCR熔解曲线法快速检测与药敏试验对比试验 .........54-56 
3.3.2 检测时间评价结果 ....................56 
3.3.3 试剂盒检测水平的评价................. 56-59 
3.3.4 不同仪器检测的评价结果 ..............59-61 
3.3.5 试剂盒稳定性评价结果 ...............61-62 
3.3.6 污染情况评价结果................ 62 
3.3.7 结果判读复杂性评价结果 ................62-64 
3.3.8 其它评价结果 .............64-65 

讨论

由于结核分枝杆菌生长缓慢，使得传统的检测方法费时费力，而以分子生物学为基础的快速检测技术不断出现，给结核病的诊断和治疗带来了新的生机，诊断时间大量缩短，操作上也越来越简单，这些技术有的已经走向市场或者已经进入临床试验。其中，李庆阁教授及其课题组发明的焚光PCR恪解曲线法也正在转化成产品，部分检测试剂盒己经走向市场。产品的性能虽然在研发阶段经过了大量的测试和考察。但是，仍然缺乏大量临床的使用情况数据。本章节就是通过对大量临床标本的检测来从多个方面考察试剂盒的性能。
............................

总结

综合多方面的评估结果，我们认为，荧光PCR熔解曲线法是简单快速、可靠实用的检测技术，基于该方法的试剂盒具有灵敏度高、特异性好、能有效避免污染的优良特点，具有较好的临床应用意义。
........................
参考文献:


本文编号：9105

资料下载
论文发表

本文链接：https://www.wllwen.com/shoufeilunwen/shuoshibiyelunwen/9105.html

上一篇：外科手术患者照护者照护能力、照护负荷及相关健康教育需求的研究  
下一篇：唾液酸的饮食干预对仔猪齿状回神经细胞及海马BDNF含量的影响
论文发表
最近更新
教材专著
热点文章

Copyright(c)文论论文网All Rights Reserved | 网站地图 |

版权申明：资料由用户032ff***提供，本站仅收录摘要或目录，作者需要删除请E-mail邮箱bigeng88@qq.com