小柴胡汤抗抑郁作用、调节脑内神经递质和雌性激素的机制研究

【摘要】 小柴胡汤首见于《伤寒杂病论》,是治疗少阳证的经典名方。因少阳证症状“胸胁痞满,默默不欲饮食,心烦喜呕”等与现代医学中的抑郁症症状相似,提示小柴胡汤可能具有抗抑郁作用；临床实践中有运用小柴胡汤治疗抑郁症的报道。本课题组前期研究发现小柴胡汤具有增加大鼠脑内单胺类神经递质含量的作用,然而系统地对小柴胡汤抗抑郁作用的实验研究却鲜有报道。本文拟采用多种抑郁症动物模型,对小柴胡汤的抗抑郁作用进行研究,并结合抑郁症发病机制在神经递质、神经营养因子和雌性激素方面的新进展,采用多种药理学手段,从行为、神经生化、蛋白等水平对其抗抑郁作用机制进行探讨。首先研究了小柴胡汤在小鼠行为绝望模型中抗抑郁作用的量效和时效关系,结果发现小柴胡汤临床等效量(7g/kg)在小鼠悬尾实验和强迫游泳实验中均显著缩短不动时间,1/3临床等效量(2.3g/kg,小鼠；1.7g/kg,大鼠)的小柴胡汤均缩短强迫游泳实中不动时间,并且对自主活动无显著影响,其中给药2周时药效最佳,提示小柴胡汤对大小鼠行为绝望模型均具有抗抑郁作用。为进一步确认小柴胡汤的抗抑郁作用,本文采用药物诱发所致抑郁模型进行了研究。发现小柴胡汤可显著抑制利血平诱导的小鼠体温降低和眼睑下垂症状,并可以显著增加5-HTP诱导的小鼠甩头次数,说明小柴胡汤具有抗抑郁作用且其机制与调节单胺类神经递质水平尤其提高脑内5-HT含量有关。为探讨小柴胡汤抗抑郁的神经递质机制,采用HPLC-ECD方法发现小柴胡汤显著增加行为绝望模型小鼠和大鼠海马、皮层和纹状体内的DA、5-HT及其代谢产物DOPAC和5HIAA的含量,并且降低DA/DOPAC和5-HT/5-HIAA的值；随后采用脑微透析结合HPLC-FLD法检测大鼠海马内氨基酸类神经递质,发现小柴胡汤显著降低大鼠海马透析液中Glu的含量。说明小柴胡汤在行为绝望模型中体现的抗抑郁作用与维持脑内神经递质的稳态有关。本文采用多种不可预见性温和刺激(Chronic unpredictable mild stress, CUMS)制备大鼠抑郁模型,进行了小柴胡汤抗抑郁药效的确认,并从神经营养因子角度探索小柴胡汤的抗抑郁作用机制。结果发现小柴胡汤显著逆转了CUMS引起的大鼠自主活动的减少、糖水偏爱的降低和摄食量的下降,同时抑制了CUMS引起的大鼠海马内NeuN表达减少、逆转了脑源性神经营养因子(BDNF)和神经生长因子(NGF)及其受体TrkB和TrkA表达的下降,并且激活了受体下游PI3K/Akt/CREB通路。说明小柴胡汤抗抑郁作用可能与调节神经营养因子、激活神经营养因子受体下游通路、保护神经元功能有关。最后本文采用C57BL/6小鼠断乳孤养模型对小柴胡汤的抗抑郁作用及与雌、孕激素调节的关系进行考察,发现小柴胡汤可显著逆转孤养引起的行为绝望状态时间的延长,也显著抑制孤养诱导的小鼠自主活动的增多和攻击行为加剧等焦虑样行为。并且小柴胡汤对孤养诱导的小鼠脑内雌二醇和孕酮的降低具有显著升高作用,同时显著激活雌二醇和孕酮受体下游ERK和CREB通路的相关蛋白,说明小柴胡汤对小鼠孤养模型的抗抑郁作用可能与调节脑内雌、孕激素和受体下游通路有关。综上,本研究发现小柴胡汤对多种因素所致抑郁症模型的抑郁行为均有改善作用,作用机制可能与维持各类神经递质的稳态、增强神经营养、调节雌、孕激素及其下游信号通路、保护神经元有关。本文揭示了小柴胡汤抗抑郁作用的可能机制,为进一步阐明其抗抑郁作用的靶点研究奠定了基础,也为研发以小柴胡汤为基础的治疗抑郁症的中药复方新药提供了科学依据。 

前言

1．抑郁症概述
迄今为止，关于抑郁症的病因并没有确切的解释，但近些年研究表明抑郁症的发生受神经生化、神经再生、神经内分泌和社会环境、遗传和药物诱发诸多因素的影响。随着现代社会的高速发展，竞争日益激烈，人们长时间的处于高压力，快节奏的生活状态下，伴随而来的长时间处于焦虑不安中都会促使抑郁症发病，因此，社会环境因素是抑郁症诱发的一个不可忽略的因素，长期生活在离异家庭或者单亲家庭的儿童患抑郁症的几率偏高，充满家庭暴力的家庭也极其容易导致抑郁症的发生。

2.抑郁症的发病机制
抑郁症的发病机制到目前为止还没有彻底研究清楚，诸多学者提出了几种假说，主要包括单胺类神经递质假说、内分泌假说和神经可塑性假说等。这些假说能够部分解释抑郁症的发病机制，但都有其局限性。下面对抑郁症主要的几种发病机制进行简述。
近年来认为，中枢神经系统的形态结构变化是抑郁症发病的基础。其中抑郁症发病的生物学机理中，中枢单胺类神经递质系统功能棄乱假说己经成为最重要的假说，被大部分学者所认同。单胺类递质系统，主要包括轻色胺能神经系统、多巴胺能神经系统和去甲肾上腺素能神经。单胺假说认为抑郁症是脑中单胺能神经元功能不足，单胺类神经递质减少而多数抗抑郁药是通过升高突触间隙单胺递质的水平发挥抗抑郁作用的。其中，经色胺系统功能素乱和神经递质的减少是导致抑郁症的发病机制之一。精神活动同时受多巴胺能神经元的调节，中脑边缘皮质系统在精神活动和情绪表达中起到十分重要的作用。近些年大量的实验证实了多巴胺假说，其中，研究在获得性无助抑郁症动物模型中发现，实验动物的尾状核及伏隔核的耗尽，当给予动物多巴胺受体激动剂后，耗尽的行为学状况得到改善。
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第一章小柴胡汤在行为绝望模型和药物诱发模型中的抗抑郁作用研究

1.1前言
药物诱发模型是另一类对抗抑郁作用药效进行初步蹄选的模型，其特点不仅可以在行为学上快速评价药效，还可以在药效评价的同时，根据选用模型的不同推断出药物抗抑郁作用的可能机制。这类模型包括利血平诱导小鼠体温降低和眼睑下垂模型、诱导的小鼠甩头模型、阿扑吗啡拮抗模型、小鼠育亨宾增强模型和苯丙氣戒断模型等。多年前就己经根据抑郁症患者的单胺类神经递质耗竭的现象提出了抑郁发病的单胺假说，患者脑内的轻色胺的含量降低也是公认事实。而利血平诱导小鼠体温降低和眼险下垂模型及轻色氨酸诱导的小鼠甩头模型是最常用的评价抗抑郁药物单胺机制的模型。利血平是一种单胺递质耗竭剂，它可以耗竭突触小泡内的单胺类神经递质以及代谢物。

1.2实验材料
小柴胡汤在行为绝望模型中抗抑郁作用药效初蹄动物的蹄选将小鼠放入自主活动仪内，记录内的活动次数，内自主活动次数在次的小鼠为合格鼠进行实验，其余小鼠副除不用。给药剂量的选择依据小鼠行为绝望模型进行抗抑郁作用药效的初蹄，选取临床等效量为中剂量，上下各取两个三倍的剂量共五个剂量，和进行实验。实验分组及给药如图所示，小鼠共计只，每部分只。每部分小鼠随机分为组，每组只。空白对照（同体积蒸馆水）组、阳性对照阿米替林组、小柴胡汤，各组每天灌胃给药次。第一部分共给药天，其中第天进行，第天进行第二部分共给药天，第天进行悬尾实验，第天进行强迫游泳实验；第三部分共给药天，第天进行悬尾实验，第天进行强迫游泳实验。

第三章小柴胡汤对大鼠慢性不可预见性温和应激模型的保护作用及可能机制.................49
3.1前言......49
3.2实验材料............................51
第四章小柴胡汤对小鼠孤养模型的保护作用及对脑内雌二醇和孕酮的调节作用....................71
4.1前言....................71
4.2实验材料..........................72
全文结论...................84

第四章小柴胡汤对小鼠孤养模型的保护作用及对脑内雌二醇和孕酮的调节作用

4.1前言
雌性激素主要分为两类，即雌激素和孕激素，雌激素主要代表为雌二醇，孕激素是由卵巢的黄体细胞分泌，主要以孕酮为主。临床研宄表明，无论男性还是女性抑郁症患者血清雌二醇水平均降低，治疗前雌二醇水平与、分数呈负相关，与减分率呈正相关，即雌二醇与抑郁症的病情严重程度呈负相关，与抗抑郁疗效呈正相关。提示血清雌二醇水平有可能成为预测抑郁症患者疗效的一个指标。另外，是线粒体内合成的神经类固醇母体，可进一步代谢转化成、等激动性神经类固醇。文献报道，抑郁患者脑脊液中含量低于正常人，在治疗重症抑郁患者的临床研宄中发现，给予酮康挫治疗的患者血清含量显著增加，同时抑郁症状缓解。目前对抑郁症患者体内含量变化的报道并不一致，但大量研宄证实，的代谢产物是强效的变构调节因子，具有明确的抗抑郁、抗焦虑作用。

4.2实验材料
实验前一天，把1只空白鼠作为入侵鼠放入孤养鼠的饲养笼内，孤养小鼠会对“入侵鼠”进行攻击，行为表现为：在笼底部袭击空白鼠的尾巴、尖叫并撕咬。观察内孤养鼠对群养鼠的攻击行为，记录攻击行为总时间。给药前一天和第4周结束，即造模第10周，为避免多次进行行为学实验使小鼠消耗体力过大而影响其他指标的检测，每组取一半的小鼠进行悬尾实验（另一半的小鼠进行强迫游泳实验），具体方法见第一章。
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全文结论

小柴胡汤对行为绝望模型、药物诱发模型、大鼠模型和小鼠孤养模型均具有显著抗抑郁作用。小柴胡汤抗抑郁作用与对单胺类神经递质和以及和功能的调节有关，并且与对氨基酸类神经递质的调节有关。小柴胡汤抗抑郁作用与对血清皮质酮的调节有关，小柴胡汤抗抑郁作用与增加神经营养因子的表达，促进神经营养因子下游通路的活化，进而保护神经元，增强神经元的功能，维持神经递质合成和分泌的稳态等有关。小柴胡汤抗抑郁作用与增加脑内雌二醇和孕酮含量，激活雌二醇及孕酮受体下游通路有关。
首次在多种抑郁动物模型上确证了小柴胡汤的抗抑郁作用、首次发现小柴胡汤对血清皮质酮水平和脑内、的含量具有调节作用、对脑内和的表达具有增加作用并对其受体下游通路具有激活作用。首次发现孤养可以降低小鼠脑内雌二醇、孕酮表达水平及其受体下游通路各蛋白活化水平，小柴胡汤可显著逆转孤养诱导的该两种雌性激素及其受体活化水平.

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