CaMKⅡδ及bcl-2、bax在新西兰大白兔心肌肥厚模型中的作用研究
【摘要】 目的：探讨新西兰大白兔心肌肥厚时CaMK Ⅱδ和凋亡基因bcl-2、bax在其心肌组织中的表达规律及相互关系,明确CaMK Ⅱδ及凋亡基因bcl-2、bax在肥厚心肌中的作用,进一步明确心肌细胞凋亡的调控机制,为临床研发防止心肌肥厚、减少心肌细胞凋亡及心力衰竭发生的新药提供新思路和方向。方法：1、40只新西兰大白兔按随机原则分为实验组及对照组,每组各20只,雌雄不限,实验组新西兰大白兔采用腹主动脉缩窄术进行心肌肥厚造模,对照组新西兰大白兔仅行开腹手术,不缩窄腹主动脉即关闭腹腔。术后8周分别对实验组和对照组进行超声心动图检查,确定实验组造模成功后,分别处死实验组及对照组新西兰大白兔,并留取心脏标本进行检测。2、采用荧光定量PCR检测实验组及对照组新西兰大白兔心肌组织中CaMKHⅡδ、bcl-2及bax的表达量。3、统计学分析,比较实验组和对照组心肌组织中CaMK Ⅱδ和bcl-2、bax表达量的变化关系,以及CaMK Ⅱδ和bcl-2/bax表达情况的相关性分析。结果：1、实验组新西兰大白兔术后8周均出现室间隔(IVS)和左室后壁(LVPW)的明显增厚(P<0.05),为明显心肌肥厚的表现,而射血分数(EF)及舒张末(LVDd)、收缩末(LVDs)未见明显差异(P>0.05),表明术后8周实验组新西兰大白兔均出现明显的心肌肥厚表现,而对照组相应指标未见明显改变；2、与对照组相比,实验组新西兰大白兔心肌组织中CaMKⅡδ的表达明显增加(P<0.01)：3、与对照组相比,实验组新西兰大白兔心肌组织中bcl-2表达减少而bax表达增加,差异有明显统计学意义(P<0.05),bcl-2/bax比值明显减小(P<0.05)；4、实验组新西兰大白兔心肌组织中CaMK Ⅱδ表达量增加与bcl-2/bax比值减小呈明显相关性,而对照组未见有明显的相关性。结论：1、通过腹主动脉缩窄术建立心肌肥厚模型的方法是可性并有效的,超声心动图检查可较好地反映心肌肥厚的程度,主要表现在LVPW及IVS增厚,说明实验组新西兰大白兔在腹主动脉缩窄术后8周均出现左室肥厚,对照组无明显变化,表明8周的造模时间已经足够让其明显出现左室肥厚；实验组及对照组EF均未见有明显变化,表明心力哀竭的发展需要更长的时间；2、CaMK Ⅱδ信号转导通路是心肌肥厚形成重要环节之一,同时心肌肥厚时伴有明显的心肌细胞凋亡,二者呈明显相关性,表明CaMK Ⅱδ表达增加可能通过降低bcl-2/bax而诱导心肌细胞凋亡,共同导致心肌肥厚。
引言
一直以来，心脑血管疾病是发达国度的重要去世亡缘故原由，比年来我国的抱病率明显上升，严峻影响中老年人的康健。病理性心肌肥厚(Pathological myocardial hypertrophy)是心脏对压力、容量超负荷等应激的一种顺应性反响，是浩繁心血管疾病的配合病理历程，常见于高血压、冠心病、心肌梗去世、心瓣膜病、天本性心脏病等多种心血管疾病。病理性心肌肥厚是心血管疾病的独立伤害因子，它可以明显增长室性心律变态、心力弱竭乃至心源性猝去世等心血管不测变乱的产生11]，因此研究心肌肥厚的产生生长，赐与以早期干涉处置处罚、逆转肥厚，具有重要的意义。
现在临床患者固然颠末恒久服用降压药等血压得到较好的控制，但心肌肥厚的产生仍得不到有用缓解，现在治疗心肌肥厚的药物重要有：1、血管告急素转换酶克制剂（ACEIs)，如依那普利等；2、血管告急素II受体阻断剂(ARBs)，如氯沙坦等；f丐离子拮抗剂，有报道表现《丐离子拮抗剂是反抗心肌肥厚最好的药物，明显优于ACEIs,常用的销苯地同等；3、别的的如利尿剂等，一样通常不但独利用，多与别的抗心肌肥厚药物团结用药。临床抗心肌肥厚治疗已经被证明不但能进步左室贯注及冠状动脉储备，还能淘汰心律变态、猝去世等的产生，进步心血管疾病的预后结果。但现在临床抗心肌肥厚药物其机制研究仍未非常明白。
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第一部分文献硏究
一、心肌肥厚的分子机制硏究进展
心肌肥厚（Myocardial hypertrophy)是心脏对各种刺激所产生的适应性增生，其表现为心肌细胞体积的增大，非心肌细胞（如成纤维细胞、胶原等）的生成与增殖，同时伴有心室结构和功能的改变。心肌肥厚时，心肌细胞的蛋白合成增加、体积增大、直径增长，心肌肌节数量增多，纤维组织增生，而心肌细胞的数量却没有增加，常伴有胚胎基因再表达。其主要的病理变化包括心肌细胞肥大、心肌间质增生以及心肌细胞外基质重建等。心肌肥厚的发病机制与压力负荷增加、神经内分泌因素、钙离子超载、原癌基因等密切相关'5—7]。
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二、 Ca2+/鈣调蛋白依赖性蛋白激酶n (CaMKII)与'心肌肥厚的研究进展
细胞内Ca2+在多种不同的细胞功能中均起着重要的作用。许多研究表明[16-181：细胞内Ca2+信号的改变是心肌肥厚反应的首要刺激，在心肌肥厚和基因表达中发挥主要的作用。研究发现，Ca2+可经多条信号途径诱导心肌肥厚的形成：
(1)Ca2+通过结合调蛋白(CaM)激活Ca2+-CaM依赖性的蛋白激酶(CaMK)，诱导心肌增强因子(MEF2)表达增多参与心肌肥厚；
(2)Ca2+激活钙调憐酸酶(calcineurin, CaN),激活的《丐调憐酸酶可以刺激胞衆活化T细胞核因子去憐酸化，使之进入核内与GATA4转录因子结合，促进心肌肥厚的发生；
(3)Ca2+-二酰基甘油-蛋白激酶C-丝裂素活化蛋白激酶通路；
(4)Ca2+-肌球蛋白轻链激酶(MLCK)途径；
(5)Ca2+直接入核与钙结合蛋白结合等多种信号通道介导心肌肥厚。
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第二部分 实验研究 .........................19-27
一、动物模型 ........................19-20
(一) 材料 .........................19
(二) 模型制备 .......................19-20
(三) 超声心动图检查 ...............20
二、实验方法 .........................20-24
(一) 引物设计 .................21
(二) 组织细胞总RNA制备(异硫氰酸胍GCT法) ............21-22
(三) 逆转录反应 ..............22-23
(四) 荧光定量(SYBR Green Ⅰ Assay) .............23-24
(五) 统计分析 .............24
三、研究结果 ..............24-27
(一) 动物模型变化................ 24-25
(二) 心脏重量变化 .................25
(三) 荧光定量PCR结果变化.............. 25-27
第三部分 分析与讨论
近年来研究表明'53^{病因素通过肥大信号刺激引起细胞反应改变的信号传导途径是心肌肥厚发病的关键。心肌肥厚时存在Ca2+信号紊乱和基因表达异常，细胞内Ca2+浓度升高是心肌肥厚信号转导发生、发展的中心环节。而心脏作为泵的主要功能很大程度上取决于心肌细胞，研究表明心肌肥厚时伴有明显的心肌细胞凋亡的发生，但其发生机制仍未十分明确。
本研究通过腹主动脉缩窄术建立新西兰大白兔心肌肥厚的动物模型，研究Ca2+依赖的蛋白激酶和凋亡基因的表达规律及关系，探讨Ca2+信号与细胞凋亡在心肌肥厚发生过程中的病理生理意义，以进一步阐明心肌肥厚形成的机制。
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结语
随着生活方式的改变，心血管疾病目^是世界h发病率和致死率很A-的疾病之--，最新研究已证明心肌肥厚是心血管疾病的独立危险因子，它"UA^ifl加心源性猝死、慢性心力衰竭和室性心律失常等心血管意外事件的发生率和死0卞，故研究心肌肥厚发生发展，予以早期干预、逆转肥厚，具有重要的意义。
本研究通过腹主动脉缩窄术建立新西兰大白兔心肌肥厚模型，探i、t肥的心肌组织中CaMK ]15和凋亡基因bcl-2、 bax /H心肌组织的表达规忭，明确CaMK II 5对心肌细胞凋亡的调控机制，为临床研发减少心肌细胞凋1::,防止心肌肥I1/发生的新药提供新思路。
研究证明CaMKll的过度表达4心肌细胞凋1:：均参4了心肌肥^的发屮机制，M新研究也表明CaMKll通过对相关凋亡^W进行调节，从而引起心肌细胞凋广，参与心肌肥厚的发生，心肌细胞是代偿性心肌肥厚发展为心力衰竭的--个Tt^H-折点，这将为临床丌发具有特异性抑制细胞凋1'：的新药研究及使用时间提供依抝；和方向。如我们可以设计多种途径来抑制CaMKll的药物，如抑制CaMKII催化区ATP结合、维持CaMK II抑制性构象、阻止CaMK II与靶蛋A相结合、阻止CaM结合到caMK ]1和附止CaMK 11非Ca2+依赖性活化的药物(如氧化应激)。随若对CaMK 11 {,j ''}H' 3途径的深入研究，CaMK II可望成为未来心肌肥厚和心袞治疗的新靶点。
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本文编号：9209
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