多巴胺相关调节蛋白及内质网应激蛋白在慢性吗啡依赖致VTA和SN神经损伤中的作用

发布时间：2018-05-07 06:03

  本文选题：吗啡依赖 + Nurr1　； 参考：《河北医科大学》2016年博士论文

【摘要】：据世界卫生组织(world health organization,WHO)发布的关于吗啡滥用情况报告显示,近年来吗啡的滥用仍呈增高趋势,导致了一系列严重不良后果。以往研究表明,吗啡对全身各系统可造成不同程度的损害。如,对心、肺的损害,对中枢神经系统的直接作用以及对呼吸中枢的抑制等,导致大脑急、慢性缺血低氧,进而引起神经细胞、神经纤维发生相应的损伤。以往研究证实中脑多巴胺系统几乎参与了所有依赖性药物的奖赏效应,被认为是奖赏效应的最后通路。中脑多巴胺神经细胞以及它们的投射区域与神经通路调节密切相关,是一系列包括精神障碍以及成瘾的形成与维持等适应性变化的基础。吗啡依赖可导致中脑多巴胺系统一系列分子和细胞功能适应性改变,使神经结构发生重塑,成瘾者失去抗拒药物的能力,从而产生持续性的渴求及复吸。在参与中脑多巴胺神经细胞发育以及生理功能的众多转录因子中,Nurr1(nuclear receptor related factor 1)和Pitx3(pituitary homeobox 3)发挥着重要的作用,它们不仅决定着多巴胺神经递质的特性及传递,而且是多巴胺神经细胞存活和维持的重要调控基因。Nurr1是孤儿核受体超家族中的一员,是中脑腹侧背盖区(ventral tegmental area,VTA)和黑质(substantia nigra,SN)多巴胺神经细胞以及中脑以外非多巴胺神经细胞分化、迁移、成熟以及生存不可缺少的重要因子,同时还对参与多巴胺代谢相关基因酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)的转录发挥着重要的作用。另一个对多巴胺神经细胞发育以及生存和维持起着重要作用的转录因子是同源蛋白Pitx3。编码Pitx3的基因只表达在中脑多巴胺神经细胞中,并且它与其他相关因子共同作用参与多巴胺神经细胞的分化和维持。以往有研究显示小鼠在给予可卡因注射后可以导致Nurr1和Pitx3表达量显著性的降低,表明这些因子可以调节神经适应过程,从而引起多巴胺神经环路的改变以及神经结构的重塑,最终可能导致更为严重的神经损伤。内质网应激是应激细胞发挥自我保护的一种机制,但过度的内质网应激反应可造成组织细胞的病理性改变。目前的研究已证实内质网应激不仅在神经退行性疾病导致的神经细胞死亡和发病机制中起重要作用,而且在毒品依赖过程中同样存在内质网应激,但缺乏详细的报道。发生内质网应激时,内质网分子伴侣葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78,GRP78)与未折叠或错误折叠蛋白结合,从而使其与内质网跨膜蛋白受体双链RNA依赖的蛋白激酶样内质网激酶(PKR-like endoplasmic reticulum kinase,PERK)、1型跨膜蛋白激酶(inositol requirement 1,IRE1)和激活作用转录因子6(artificial transcription factor 6,ATF6)解离,从而激活这三条信号通路,促进蛋白质的正确折叠,对细胞具有保护作用。但是过强或者持续时间过长的内质网应激可损害内质网功能,PERK和ATF6的启动又会促进CHOP的激活,增加其表达量,CHOP的高表达使得内质网应激达到顶峰,可诱导细胞凋亡的发生。Caspase12作为内质网应激反应时诱导凋亡的关键分子,仅在内质网应激时被激活,在线粒体或死亡受体凋亡过程中不被激活。Caspase12从无活性酶原的形式发生重组,切割并激活caspase9酶原,继而启动caspase3经典凋亡途径,最终导致细胞凋亡。因此,caspase-12被认为是内质网应激时的标志性分子,在促凋亡通路中具有重要的作用。虽然目前的研究表明慢性吗啡依赖可导致神经细胞的损伤,但在损伤过程中中脑VTA和SN多巴胺神经细胞的病理性改变以及参与损伤的相关调节蛋白的表达变化及作用机制目前尚不清楚,因此,本研究旨在模拟人类长时程慢性吗啡依赖的状态,建立不同时程慢性吗啡依赖大鼠模型,从病理形态学角度观察慢性吗啡依赖对中脑VTA及SN多巴胺神经细胞的影响,同时对中脑多巴胺神经细胞相关调节蛋白Nurr1、Pitx3和TH以及内质网应激蛋白GRP78、P-e IF2α、ATF6、CHOP及凋亡蛋白caspase-12、caspsae-3在慢性吗啡依赖导致的神经损伤中的表达变化及相互作用关系进行探讨,为多巴胺神经损伤的深入研究及新的药物靶点的寻找提供新的途径。第一部分不同时程慢性吗啡依赖大鼠模型的建立以及病理学观察目的:建立不同时程慢性吗啡依赖大鼠模型,通过常规组织病理学染色、组织化学特殊染色及Fluoro-Jade B荧光标记,观察不同时程慢性吗啡依赖对VTA及SN多巴胺神经细胞的影响。方法:1采用背部皮下递增注射盐酸吗啡的方法,建立吗啡依赖模型。通过盐酸纳洛酮皮下注射诱发戒断症状,给予评分,确认吗啡依赖后建立不同时程慢性吗啡依赖大鼠模型。2对各组大鼠体重进行检测,观察不同时程慢性吗啡依赖对大鼠体重的影响。3 HE染色观察不同时程慢性吗啡依赖大鼠中脑VTA和SN的病理学改变。4硫瑾染色观察不同时程慢性吗啡依赖大鼠中脑VTA和SN多巴胺神经细胞尼氏体及形态改变。5 Fluoro-Jade B荧光染色检测不同时程慢性吗啡依赖大鼠VTA和SN多巴胺神经细胞变性死亡的情况。结果:1吗啡依赖各组出现明显戒断症状,对戒断症状进行评分,与正常对照组相比具有显著性差异(P0.05),说明吗啡依赖大鼠模型建立成功。2随时间的延长正常对照组大鼠体重呈较明显增加趋势。吗啡依赖组一周时体重略有下降,一周以后体重也呈增加趋势,但与正常对照组体重相比,体重较低且具有显著性差异(P0.05)。3 HE染色结果表明随着慢性吗啡依赖时间的延长,VTA和SN区组织出现水肿、噬神经现象、胶质细胞增生,细胞固缩。4硫瑾染色结果表明随着慢性吗啡依赖时间的延长,VTA和SN区组织出现结构不清,细胞内尼氏体排列不规则、消失,细胞固缩深染。5 Fluoro-Jade B染色结果表明VTA和SN多巴胺神经细胞发生了变性死亡。小结:本部分实验在成功建立不同时程慢性吗啡依赖大鼠模型的基础上,通过HE染色、硫瑾染色、Fluoro-Jade B荧光标记结果显示:随吗啡依赖时间的延长,VTA及SN的多巴胺神经细胞从最初的组织水肿、噬神经现象、胶质细胞增生、尼氏体消失逐渐演变为神经细胞的死亡,提示长时程慢性吗啡依赖可导致VTA及SN多巴胺神经细胞的变性死亡。第二部分不同时程慢性吗啡依赖对中脑多巴胺相关调节蛋白Nurr1,Pitx3,TH表达的影响目的:通过系统观察多巴胺调节蛋白Nurr1、Pitx3和TH的表达变化以及相互之间的关系,明确Nurr1、Pitx3和TH是否参与了慢性吗啡依赖导致的神经损伤,为慢性吗啡依赖导致神经损伤的机制研究提供形态学依据,为吗啡导致神经损伤的治疗提供新途径。方法:1免疫组化观察不同时程慢性吗啡依赖对VTA及SN多巴胺神经细胞特异性标记物TH的影响。2免疫荧光双标观察不同时程慢性吗啡依赖对VTA及SN多巴胺神经细胞相关调节蛋白Nurr1和Pitx3的影响及与TH的相关关系。3 Western blot检测不同时程慢性吗啡依赖对VTA及SN多巴胺神经细胞中TH、Nurr1和Pitx3蛋白含量的影响。结果:1 VTA和SN免疫组化TH检测结果:随吗啡依赖时间的延长TH阳性细胞数目逐渐减少。2 VTA和SN免疫荧光双重标记:Nurr1与TH、Pitx3与TH的双重标记显示Nurr1和Pitx3阳性细胞数目随吗啡依赖时间的延长呈明显减少趋势。3 Western blot检测VTA和SN TH蛋白表达结果:与正常对照组相比吗啡依赖1周组表达少量上调,但无统计学意义(P0.05);随吗啡依赖时间的延长,吗啡依赖3周组与正常对照组相比表达降低(P0.05),吗啡依赖6周组与正常对照组相比表达明显降低(P0.01)。4 Western blot检测VTA和SN Nurr1、Pitx3蛋白表达结果:与正常对照组相比吗啡依赖1周组表达上调(P0.05),随吗啡依赖时间的延长,与正常对照组相比吗啡依赖3周组表达降低(P0.05),与正常对照组相比吗啡依赖6周组表达明显降低(P0.05)。小结:慢性吗啡依赖使多巴胺调节因子Nurr1、Pitx3的表达降低,不能有效调控TH的表达,多巴胺神经细胞的生存受到了影响,导致多巴胺神经细胞的明显损伤。提示慢性吗啡依赖中Nurr1、Pitx3及TH表达的降低可能是引发多巴胺神经细胞损伤的重要途径之一。第三部分不同时程慢性吗啡依赖对内质网应激相关蛋白表达的影响目的:通过检测内质网应激蛋白GRP78、P-e IF2α、ATF6、CHOP及凋亡蛋白Caspase-12、caspsae-3的表达变化,探讨慢性吗啡依赖导致的多巴胺神经细胞损伤,是否有上述内质网应激蛋白及凋亡蛋白的参与,为依赖性药物导致的神经损伤的防治提供科学依据。方法:1多重荧光标记,共聚焦显微镜观察不同时程慢性吗啡依赖VTA及SN多巴胺神经细胞中内质网应激蛋白GRP78,P-e IF2α,ATF6、CHOP及凋亡蛋白Caspase-12、caspsae-3的表达变化。2 Western blot检测不同时程慢性吗啡依赖VTA及SN多巴胺神经细胞中内质网应激标志蛋白GRP78以及CHOP蛋白半定量变化。结果:1免疫荧光多重标记VTA和SN多巴胺神经细胞GRP78、P-e IF2α、ATF6、CHOP、Caspase-12、caspsae-3与TH免疫荧光多重标记(激光共聚焦显微镜观察):随慢性吗啡依赖时间的延长,GRP78、P-e IF2α、ATF6、CHOP与TH共表达的阳性细胞数目呈现了先增加后略降低的趋势;Caspase-12、caspsae-3阳性表达随吗啡依赖时间延长呈现升高趋势。2 Western blot检测VTA和SN区GRP78、CHOP蛋白半定量结果显示,与正常对照组相比随吗啡依赖时间的延长,蛋白表达呈现了先增加后略降低的趋势(P0.05),与免疫荧光多重标记结果相一致。小结:慢性吗啡依赖可导致多巴胺神经细胞中内质网应激蛋白GRP78、P-e IF2α、ATF6、CHOP及凋亡蛋白Caspase-12、caspsae-3的表达变化。其中PERK,ATF-6信号通路的激活,导致了内质网应激标志蛋白CHOP的表达增高,同时凋亡蛋白Caspase-12、caspsae-3表达也呈现了上调趋势。提示内质网应激的激活可能通过诱导凋亡而参与慢性吗啡依赖导致的多巴胺神经细胞损伤。第四部分不同时程吗啡刺激对多巴胺性MN9D细胞内质网应激相关蛋白表达的影响目的:检测内质网应激蛋白GRP78、P-e IF2α、ATF6、CHOP及凋亡蛋白Caspase-12、caspsae-3在不同时程吗啡刺激后的表达变化,进一步印证整体实验结果。方法:1免疫荧光标记MN9D细胞及SH-SY5Y细胞中TH表达情况,并比较其数量。2 MTT检测不同浓度吗啡刺激MN9D细胞生存率。3免疫荧光检测不同时程吗啡刺激MN9D细胞中内质网应激蛋白GRP78、P-e IF2α、ATF-6、CHOP及凋亡蛋白Caspase-12、caspsae-3表达变化。4原位末端标记(TUNEL)检测MN9D细胞中凋亡情况。结果:1 MN9D细胞和SH-SY5Y细胞中部分细胞TH呈阳性表达,且MN9D细胞TH阳性细胞数目较SH-SY5Y细胞阳性细胞数目多,且存在明显差异(P0.05)。2 MTT检测结果表明:1μM吗啡作用MN9D细胞24h后,MN9D细胞存活率显著下降(P0.05),且MN9D细胞的存活率随着吗啡药物浓度的升高而降低。3免疫荧光染色结果表明随着吗啡刺激时间的延长,MN9D细胞中内质网应激蛋白GRP78、P-e IF2α、ATF-6、CHOP及凋亡蛋白Caspase-12、caspsae-3的表达增加。4原位末端标记(TUNEL)检测细胞凋亡:正常对照及吗啡刺激24h未见凋亡细胞,吗啡刺激48h可见个别凋亡细胞,72h可见散在凋亡细胞。小结:1 MN9D细胞中的TH阳性细胞数目明显多于SH-SY5Y细胞是多巴胺成瘾机制深入研究理想的细胞系。2随吗啡刺激时间的延长MN9D细胞中内质网应激蛋白GRP78、ATF-6、P-e IF2α、CHOP及凋亡蛋白Caspase-12、caspsae-3表达增高参与了细胞凋亡的发生。结论:本研究以不同时程慢性吗啡依赖大鼠模型为主要研究对象,结合体外吗啡刺激细胞模型系统观察吗啡对VTA及SN多巴胺神经细胞及多巴胺性MN9D细胞的影响,得出以下结论:1慢性吗啡依赖可导致多巴胺神经细胞损伤。2 Nurr1、Pitx3及TH表达的降低影响了细胞的生存,可能参与了慢性吗啡依赖导致的多巴胺神经细胞损伤。3内质网应激的激活及其下游凋亡的发生可能参与慢性吗啡导致的多巴胺神经细胞的损伤。综上,慢性吗啡导致的VTA及SN多巴胺神经细胞损伤,一方面是相关调节因子的表达变化影响了多巴胺神经细胞的生存,另一方面是内质网应激蛋白及凋亡蛋白表达上调可能诱导细胞凋亡的发生。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：D919
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本文编号：1855694