重组慢病毒介导的LXRα-RNAi与rHuEPo联合运用改善大鼠脂肪肝供肝肝移植术后移植肝功能的实验研究

发布时间：2017-10-18 06:18

  本文关键词：重组慢病毒介导的LXRα-RNAi与rHuEPo联合运用改善大鼠脂肪肝供肝肝移植术后移植肝功能的实验研究

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【摘要】：第—部分脂肪肝供体大鼠模型的建立目的：建立稳定的大鼠中重度脂肪变性的肝脏供体模型,为进一步研究改善中重度脂肪肝供肝术后移植物功能及延长生存期的问题提供前提条件。方法：将体重60～90g SD大鼠310只随机分成对照组和模型组各155只,对照组喂饲基础饲料,模型组喂饲富含饱和脂肪酸的高脂饲料同时以56% 酒精隔天灌胃,实验期间每天观察大鼠一般情况,每周定期称量各组大鼠体重,第2、4、8周末检测大鼠肝脏指数、外周血血脂、肝功能,并评估肝组织病理学改变,按照脂肪肝组织学诊断和分级标准对大鼠脂肪肝模型进行鉴定。结果：模型组大鼠在8周末时形成脂肪浸润程度≥50%的脂肪肝,大鼠体重、肝湿重、肝脏指数、肝酶学和外周血血脂检测结果明显高于对照组(P0.05),脂肪肝发生率100%。结论：富含饱和脂肪酸的高脂饮食及酒精持续喂养SD大鼠8周成功构建了脂肪肝供体大鼠模型,成功率100%。该模型的特点为肝组织脂肪变性程度：F3-4级；以大泡性脂肪变性为主；伴随高脂血症及血清转氨酶轻度升高。第二部分携带LXRa/GV115-RNAi慢病毒载体的构建及体外对大鼠肝细胞基因表达的影响目的：运用RNA干扰技术,对大鼠LXRα基因进行基因修饰后,构建LXPα基因干扰的慢病毒载体并进行鉴定,同时对大鼠肝细胞系BRL进行转染,观察基因干扰效率。方法：第一步,首先构建成功的目的基因RNA干扰的慢病毒载体,然后设计多个RNA干扰靶点序列,选择最佳的动力学参数靶点,制备双链DNA Oligo,制备并鉴定克隆；第二步,进行RNA干扰慢病毒的包装与滴度检测,首先制备编码慢病毒颗粒的重组病毒质粒及其两种辅助包装原件载体质粒,三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提,后转染293T细胞培养扩增,得到慢病毒浓缩液后在293T细胞中测定并标定病毒滴度；第三步,使用慢病毒感染目的肝细胞系BRL,根据细胞MOI值,调整病毒量,感染3天后观察慢病毒上报告基因GFP表达情况,荧光率大于80%者,并提取RNA,使用RT-PCR法测定滴度及内源性验证基因敲减效率。结果：经查询,目的基因为Nr1h3 (LXRa),基因序列号为NM_031627,合成针对靶基因的四个携带干扰基因的慢病毒载体：Nrlh3/GV115-RNAi-LV#1,Nr1h3/GV115-RNAi-LV#2,Nr1h3/GV115-RNAi-LV#3及Nr1h3/GV115-RNAi-LV#4,目的细胞感染效率达到了80%以上,经RT-PCR测定,Nr1h3/GV115-RNAi-LV#4作为目标靶点序列的慢病毒载体敲减效率最高。经过慢病毒载体包装,最终鉴定KD4组对大鼠肝细胞系BRL的LXRα基因的干扰效率是大于80%,达到实验要求。结论：1、成功构建、合成、筛选出了LXRα-RNAi-LV,干扰效率达80%以上。2、LXRα-RNAi-LV能在体外有效转染大鼠BRL系列肝细胞并抑制LXRα基因的表达。第三部分大鼠原位脂肪肝供肝减体积肝移植模型的建立目的：建立适合脂肪肝供肝的稳定的大鼠减体积肝移植模型,解决供肝体积明显大于受体原肝体积,遮挡手术视野增加手术难度及大体积供肝血液灌注增加致受体复流后血容量不足的问题,为后续实验提供成功的动物模型保障。方法：随机各选取20对SD-SD脂肪肝供肝肝移植大鼠,对照组进行全体积原位肝移植术,实验组在供肝获取后切除肝左外侧叶(约占全肝体积30%),后继续行原位肝移植术。两组均采用“二袖套法”。供肝恢复灌流后,观察记录两组大鼠呼吸动度、呼吸频率、心跳及大血管充盈情况,术后观察大鼠一般恢复情况,解剖死亡大鼠了解死因；记录两组手术时间并作比较；两组大鼠术后进行生存分析；比较两组大鼠术后肝功能及病理组织学改变,评估两组差异性。结果：供肝恢复灌注后,全体积肝移植组受体大鼠呼吸频率、心率快于减体积肝移植组受体大鼠(P0.05),下腔静脉充盈情况原体积肝移植组大鼠相对较差；减体积组受体大鼠术后一般情况恢复好于全体积组大鼠；手术时间,全体积组修肝时间短于减体积组,但受体手术时间明显长于减体积组(P0.05),全体积组受体大鼠术后早期死亡率明显高于减体积组,主要死亡原因是腹腔出血、空气栓塞和低血容量性休克,两组受体大鼠后续存活时间比较无统计学差异；两组受体大鼠术后肝功能肝酶学和总胆红素总体无差异,病理组织学表现相似。结论：在“二袖套法”基础上建立的脂肪肝供肝大鼠减体积肝移植模型稳定可靠,并未增加受体大鼠的死亡率及肝功能不全,解决了脂肪肝供肝全体积肝移植术中术野暴露不清、术后易致受体大鼠循环失稳的问题,是研究脂肪肝供肝肝移植的理想动物模型之一。第四部分重组慢病毒介导的LXRa-RNAi与rHuEPo联合运用改善大鼠脂肪肝供肝肝移植术后移植肝功能的实验研究目的：应用携带LXRα-RNAi基因干扰的重组慢病毒载体联合rHuEPo对中重度脂肪肝供肝肝移植大鼠进行干预,以改善受体大鼠术后移植肝功能,提高生存率,为临床上对中重度脂肪肝供肝使用的进一步研究打下实验基础。方法：以第一、三部分所建成功的脂肪肝供肝大鼠减体积肝移植模型和第二部分构建及扩增的慢病毒载体为基础,实验分为五个组(n=20),联合治疗组：移植供受体大鼠接受LXRα-KNAi-LV和rHuEPo的联合治疗。脂肪肝供体大鼠在肝移植手术前72h接受经盲肠静脉至门静脉注射LXRα-RNM-LV病毒载体液1ml(为病毒液溶于ENI.S.稀释成浓度7×107 TU/ml并和感染增效剂Polybrene混合组成),脂肪肝供体大鼠在供肝切取前30min接受经门静脉注射rHuEPo稀释液lml(生理盐水溶解),用量为4000IU/kg,受体在移植肝开放复流后经尾静脉快速加压注射同等剂量rHuEPo稀释液；基因治疗组：移植供体大鼠接受jLXR∝-RNAi-LV单独治疗；rHuEPo治疗组：移植供受体大鼠接受rHuEPo单独治疗；空白病毒组：移植供受体接受空白病毒NC-LV转染和生理盐水注射；空白对照组：移植供受体仅接受生理盐水注射。肝移植术后在预定时间点4h、24h、72h处死大鼠,获取肝脏标本及血清进行相关检测,包括：冰冻切片的荧光检测,肝功能及外周血脂、肝组织内TG测定,ELISA法测定血清IL1-β和TNF-a,病理组织学变化的评估,TUNEL法检测肝组织细胞凋亡情况,免疫组化法检测NF-κBp65在肝组织中的表达情况,LXRa的RT-PCR检测和蛋白免疫印迹实验对LXRα、 SREBP-1c及CD36表达的检测以及对各组大鼠的生存评估。结果：(1)供体大鼠肝脏经门静脉转染携带GFP绿色荧光蛋白的慢病毒载体72h后,可见肝组织有普遍强绿色荧光表达,主要集中在肝小叶汇管区及中央静脉周围的肝细胞,表明慢病毒载体携带的干扰基因已高效地转染入供肝细胞。(2)生化指标检测情况：联合治疗组大鼠术后肝功能ALT和TBIL前24h升高幅度明显低于其他组(P0.05),72h时逐渐下降；而两空白组ALT前24h明显升高,72h时大幅下降,TBIL则持续升高；基因治疗组和rHuEPo治疗组数值居中,但基因治疗组升高幅度低于rHuEPo治疗组。各组外周血血脂数值比较无统计学差异。肝组织内TG含量,联合治疗组和基因治疗组明显低于其他三组(P0.05),并呈持续下降趋势。(3)细胞因子检测情况：联合治疗组两细胞因子浓度升高幅度在各时间点明显低于其他各组(P0.05)：基因治疗组两细胞因子浓度升高幅度低于rHuEPo治疗组；空白病毒组和空白对照组血清两细胞因子浓度在各时间点始终高于其他组(P0.05),两组间浓度值无差异。(4)病理组织学检查：联合治疗组和基因治疗组切片显示肝小叶中央静脉周围肝组织内脂肪蓄积减少,脂滴对肝小叶汇管区、中央静脉挤压明显减轻。经过Suzuki评分,联合治疗组肝组织病理损伤在各组中最轻(P0.05),空白病毒组和空白对照组大鼠肝组织损伤严重,72h时肝组织呈大片状坏死。(5) TUNEL染色结果：在4h时间点,联合治疗组和基因治疗组间肝细胞凋亡率无差别,但明显低于其他三组(P0.05)；24h时,联合治疗组肝细胞凋亡率明显低于其他各组(P0.05)；72h时,联合治疗组肝细胞凋亡率仍持续最低(P0.05),并较24h时有所下降,基因治疗组则排在其次,另三组相对较高。(6) NF-κBp65的表达：联合治疗组大鼠肝组织在4h平均积分吸光度值最低,24h时数值升高超过基因治疗组,72h时下降与基因治疗组无差异；rHuEPo治疗组4h时数值高于前两组但低于两空白组,24h时数值升高达高峰并明显高于其他组,72h时下降；空白病毒组和空白对照组各时间点平均积分吸光度值高于联合治疗组和基因治疗组。(7) Western blot测定LXRα、SREBP-1c及CD36的表达：联合治疗组和基因治疗组肝组织内LXRα、SREBP-1c及CD36三种蛋白相对表达水平明显低于另三组(P0.05)。(8) LXRα RT-PCR检测结果：联合治疗组和基因治疗组肝组织内LXRα mRNA相对表达量明显低于另三组(P0.05)。(9)联合治疗组术后7天生存率为80%,明显高于其他任何一组大鼠(P0.05),联合治疗组大鼠术后长时间生存率有明显提高。结论：1、经盲肠静脉属支穿刺置管门静脉灌注是慢病毒携带基因体内转染安全有效的途径,可保证大鼠存活及较高的基因转染效率,是大鼠动物实验体内基因转染的一种值得推广的方法。但慢病毒的无靶向性及仍然存在的潜在生物学危险是其局限性。2、 未经治疗≥50% 脂肪浸润的大鼠供肝,其大鼠肝移植受体术后短时间(4h)即可发生肝组织坏死,术后三天肝组织大片坏死,生存率低,原因可能是肝脏严重缺血再灌注损伤引发PNF导致。3、运用慢病毒携带LXRα-RNAi-LV的载体液经门静脉转染供肝并联合rHuEPo治疗,有效减轻了脂肪肝供肝大鼠肝移植术后移植肝的缺血再灌注损伤,提高了受体大鼠术后的存活率,延长了存活时间,其治疗效果优于单独运用LXRα基因干扰治疗或rHuEPo治疗,是一种有效改善脂肪肝移植物术后肝功能的方法,为进一步研究应用中重度脂肪肝作为供肝的课题打下实验基础。
【关键词】：中重度脂肪肝 高脂饮食 酒精 大鼠模型 LXRα RNA干扰 慢病毒载体 BRL大鼠肝细胞系 转染 脂肪肝供肝 全体积肝移植 减体积肝移植 大鼠 LXRα RNA干扰 慢病毒载体 rHuEPo 脂肪肝供肝 肝移植 缺血再灌注损伤
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R657.3
【目录】：

• 中英文缩写对照表6-7
• 前言7-9
• 中文摘要9-15
• 英文摘要15-20
• 第一部分 脂肪肝供体大鼠模型的建立20-31
• 引言20
• 实验材料及方法20-25
• 结果25-28
• 讨论28-30
• 结论30-31
• 第二部分 携带LXRα/GV115-RNAi慢病毒载体的构建及体外对大鼠肝胞基因表达的影响31-68
• 引言31-32
• 实验材料及方法32-48
• 结果48-65
• 讨论65-67
• 结论67-68
• 第三部分 大鼠原位脂肪肝供肝减体积肝移植模型的建立68-93
• 引言68
• 实验材料及方法68-81
• 结果81-85
• 讨论85-92
• 结论92-93
• 第四部分 重组慢病毒介导的LXRα-RNAi与rHuEPo联合运用改善大鼠脂肪肝供肝肝移植术后移植肝功能的实验研究93-139
• 引言93-94
• 实验材料及方法94-112
• 结果112-129
• 讨论129-138
• 结论138-139
• 参考文献139-151
• 综述151-164
• 参考文献158-164
• 攻读学位期间发表文章情况164-165
• 致谢165

【参考文献】

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本文编号：1053401