腹泻儿童及灵长类动物肠道病毒宏基因组学研究

发布时间：2017-10-19 11:21

  本文关键词：腹泻儿童及灵长类动物肠道病毒宏基因组学研究

  更多相关文章： 病毒宏基因组学 儿童及灵长类动物 腹泻 病毒群落 新型病毒 系统进化分析

【摘要】：腹泻是全球重要的公共卫生问题,是感染性疾病中引发死亡的第三位病因。急性腹泻在儿童群体内属于常见病和多发病之一,在发展中国家急性腹泻是导致婴幼儿死亡的主要主要病因之一,其致病因素主要为寄生虫、细菌和病毒感染。随着抗生素的发现和有效使用,加上水源供应和公共卫生条件的改善,寄生虫和细菌感染所导致的腹泻类疾病得到了有效控制,而病毒性腹泻大多没有有效控制和治疗方法,引起人们越来越多的关注。人类及动物消化道中存在庞大的病毒群落,这些病毒绝大多数是未知的。目前,人类对于新型病毒性腹泻仍然没有特殊的有效防治措施。因此,人类想要真正克服新型病毒导致的传染性疾病,只有通过有效的方法提前发现潜在的致病性新型病毒,在此础上对新型病毒进行基因组结构、流行病学、疫苗研究和治疗性抗体开发等方面进行深入研究,从而为病毒性腹泻防控、临床诊疗等提供理论基础和技术支持。病毒宏基因组学(Viral Metagenomics)是一种新型的病毒分子生物学检测技术,该技术的创立和发展是基于宏基因组学(metagenomics)理论,结合现有的分子病毒学检测方法开创的一个新的宏基因组学分支。该研究技术突破了传统方法的局限,直接以临床样本中的所有病毒核酸为研究对象,有效地避开了病毒细胞培养、血清病毒抗原／抗体检测和基于病毒已知序列的PCR扩增；病毒宏基因组学方法不仅能够开速检测出样品中存在的已知病毒,更为重要的是该方法还能够有效的检测出新型及未知病毒；从而可以在获得病毒基因序列的基础上解析临床标本中的病毒群落的组成甚至是病毒滴度,实时监控特定病毒动态变化及分布,揭示新型或未知致病性病毒与特定疾病之间的关联性,对于临床诊治新型或未知病毒所致疾病具有重要的理论和现实意义。灵长类动物与人类不仅体质特征很相似,而且社会行为也很相近,灵长类动物体内可能携带诸多人畜共患病病原体。因此,本研究采用病毒宏基因组学方法分析比较腹泻儿童及灵长类动物群体粪便中病毒群落的差异并挖掘潜在的新型腹泻相关病毒,研究结果对于病毒性腹泻的诊断、治疗及疾病暴发的防控具有重要的实际意义。本研究主要内容和结果如下：(一)腹泻儿童肠道病毒群落的组成构建儿童腹泻及健康对照组肠道病毒组基因文库,通过Miseq高通量测序结合生物信息学调取文库中所有可能的病毒基因,分析病毒群落的组成。结果显示儿童肠道病毒群落的组成包括：杯状病毒科(Caliciviridae),腺病毒科(Adenoviridae),微小RNA病毒科(Picornaviridae),呼肠孤病毒科(Reoviridae),噬菌体,细小病毒科(Parvoviridae),指环病毒科(Anelloviridae)及未分科病毒和少量的其他病毒。病毒群落分析提示：(1)尽管健康对照组儿童粪便样品中病毒多样性与腹泻组无明显差别,但病毒滴度显著低于腹泻组样品。(2)腹泻组和健康对照组所有文库均为杯状病毒阳性,但腹泻组病毒滴度显著高于健康对照组。 (3)星状病毒不是本研究腹泻群体的主要病因。(二)腹泻灵长类动物肠道病毒群落的组成构建灵长类动物腹泻及健康对照组肠道病毒组基因文库,通过Miseq高通量测序结合生物信息学调取文库中所有可能的病毒基因,分析病毒群落的组成。结果显示灵长类动物肠道病毒群落的组成包括细小病毒科(Parvoviridae),帚状病毒科(Virgaviridae),腺病毒科(Adenoviridae),微小RNA病毒科(Picornaviridae),噬菌体,双生病毒科(Geminiviridae)病毒,圆环病毒科(Circoviridae),修道院病毒科(Closteroviridae),二顺反子病毒科(Dicistroviridae),传染性软腐病病毒科(Iflaviridae),星状病毒科(Astroviridae),番茄丛矮病毒科(Tombusviridae), 杯状病毒科(Caliciviridae)及未分科病毒和其他病毒。病毒群落分析提示：(1)腹泻组病毒群落的组成和病毒滴度与健康对照组无明显区别。(2)灵长类动物腹泻粪便中可以感染哺乳动物的病毒主要为细小病毒和圆环病毒,但病毒滴度在两组之间无明显差异。(3)最近发现的picobirnaviridae病毒在灵长类动物肠道中广泛存在。(4)星状病毒不是本次研究的灵长类动物腹泻的主要病因。(5)灵长类动物肠道内植物病毒种类多且病毒滴度高。(三)儿童与灵长类动物肠道病毒群落的比较本研究比较儿童与灵长类动物肠道病毒群落的组成,结果提示：(1)灵长类动物肠道病毒组成的多样性高于儿童肠道病毒群落,灵长类动物肠道内病毒群落可以分为15个主要病毒科或者病毒种类,而儿童肠道病毒群落主要为9个病毒科或病毒种类组成。(2)灵长类动物肠道病毒群落中植物病毒占多数,而儿童肠道病毒群落内感染哺乳动物的病毒占多数。原因可能是由儿童和灵长类动物的食物谱不同造成的。(3)总体上灵长类动物肠道内的病毒滴度高于儿童肠道内病毒。(四)儿童及灵长类动物肠道内新型病毒及腹泻相关病毒的鉴定(1)腹泻相关的新型星状病毒本研究在儿童肠道病毒群落中发现了2种不同的新型星状病毒(HAstV-JS1和HAstV-JS2),而在灵长类动物中发现了1种新型星状病毒(MAstV-JS)。序列比对及系统进化分析表明本研究中3株星状病毒与GenBank中星状病毒毒株没有近源毒株,说明该3株星状病毒毒株为新型星状病毒。基于该3株毒株的特异性引物进行PCR检测表明HAstV-JS1在腹泻儿童群体的阳性率为12.20%,健康对照组样品均为阴性。HAstV-JS2在腹泻群体内的阳性率为10%(9/90),健康对照组样品均为阴性。MAstV-JS在腹泻灵长类动物群体的阳性率为3。5%(2/58),健康对照组均为阴性。提示本研究发现的3株新型星状病毒与腹泻有一定的相关性。(2)腹泻相关的诺如病毒本研究在腹泻儿童及灵长类动物群体的粪便样品中检测除了多个诺如病毒毒株。通过Geneious软件de novo组装成4个完整的基因组(NoV-JS1、NoV-JS2、 NoV-JS3和NoV-JS4)。4株诺如毒株与GenBank之前发现的毒株在核苷酸水平相似度大于95%,系统进化分析显示NoV-JS1与广州地区分离NoV毒株(KC894943)聚类,NoV-JS2与NoV-JS1所在的聚类群同处在同一个聚类群；NoV-JS3与另外1株广州分离的NoV毒株(KF989075)紧密聚类；NoV-JS4与我国荆州地区的NoV(KF306214)紧密聚类。提示江苏地区腹泻儿童群体内有3种不同的NoV在儿童群体流行。利用Geneious软件在灵长类动物肠道病毒群落中拼接l株诺如病毒全基因组序列。序列比对显示该株诺如毒株与GenBank中提交的唯一1株灵长类动物的calicivirus序列相似度为85%；PCR检测发现腹泻灵长类动物粪便标本该病毒阳性率为10%,说明该杯状病毒可能与灵长类动物的腹泻有相关性。(3) Picornaviridae与Picobirnaviridae本研究显示,在儿童腹泻病毒群落中,picornaviridae与儿童腹泻有一定的相关性。而在灵长类动物病毒群落中,picornaviridae家族的病毒与灵长类动物的腹泻相关性不高。儿童腹泻病毒群落内没有发现picobirnaviridae,说明picobiranviridae与本次研究的儿童腹泻无相关性。而在灵长类动物腹泻组,picobirnaviridae家族的病毒与灵长类动物的腹泻有一定的相关性。(4)新型戊型肝炎病毒样新型病毒(Hepeliviridae)本研究在灵长类动物粪便样品中发现1株新型戊型肝炎病毒样病毒(命名为MHEV-JS)。MHEV-JS全基因组为7289bp,与人类HEV相似,该基因组主要编码3个开放阅读框,其衣壳蛋白与人HEV的相似度约30%。基于RdRp蛋白的氨基酸序列及病毒基因组的核苷酸碱基组成分析结果均显示MHEV-JS属于脊椎动物病毒,说明该病毒不是来自动物食入的植物病毒或昆虫病毒。基于RdRp区设计一套巢式PCR检测引物,RT-PCR检测结果显示7份灵长类动物粪便样品为阳性,均来自同一个样品采集点,其中5份来自腹泻样品,2份来自健康对照样品,结果提示本研究中发现的新型HEV与灵长类动物的腹泻没有相关性。(5)圆环病毒及圆环病毒样病毒本研究在儿童肠道病毒群落(GemyV-JS和CycV-JS)及灵长类动物肠道病毒群落(MGemyV-JS)内发现了3个具有环形基因组的单链DNA病毒。该3株圆环病毒样病毒均含有1个Rep基因,编码病毒的环形复制酶Rep,含有一个编码病毒capsid衣壳蛋白的Cap基因。系统进化结果显示：GemyV-JS与1株分离自Dragonfly的Germycircularvirus毒株聚类,它们的Rep蛋白在氨基酸水平相似度为49.4%；MGemyV-JS与分离自人类血液的Gemuycircularvirus聚类,它们的Rep蛋白在氨基酸水平相似度为48.5%。CycV-JS与其他Cyclovirus聚类在一起,其Rep蛋白在氨基酸水平相似度为56.3-58.9%。基于该3株病毒基因组序列设计的PCR引物进行病毒基因检测,发现该3株病毒的阳性样品均只有1份,说明本研究中发现的3株环形DNA病毒均与腹泻无明显相关性。(6)灵长类动物新型腺病毒在灵长类动物病毒群落中发现1株新型腺病毒毒株(SAdV-Chl),本研究对该腺病毒毒株进行了全基因组测序,该毒株在基因组大小、基因组结构、碱基组成上与人类A型腺病毒相似,而与其他灵长类动物的腺病毒毒株明显不同。基于全基因组序列和病毒主要基因序列进行的系统进化分析,结果显示该灵长类腺病毒毒株其他4株来自人A型腺病毒毒株紧密聚类形成一个单独的分支,与其他灵长类腺病毒毒株遗传关系较远。基于腺病毒全基因组序列的重组分析表明SAdV-Ch1作亲代毒株参与病毒基因同源重组,即由SAdV-ch1和HAdV-61作为母代毒株进行基因同源重组产生子代毒株HAdV-31.以上结果提示该灵长类腺病毒毒株具有跨种间传播的潜在可能。结论：(1)本研究运用病毒宏基因组学方法成功解析了我国腹泻儿童及灵长类动物群体的肠道病毒群落；(2)灵长类动物肠道病毒群落病毒种类多样性高于儿童群体肠道病毒群落；(3)在儿童及灵长类动物肠道病毒群落内发现并鉴定了3株新型星状病毒、1株新型戊型肝炎病毒样病毒、3株圆环病毒样病毒、1株新型腺病毒；(4)灵长类动物肠道病毒群落内的新型腺病毒具有跨种间传播的潜在可能。
【关键词】：病毒宏基因组学 儿童及灵长类动物 腹泻 病毒群落 新型病毒 系统进化分析
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R725.7
【目录】：

• 摘要6-11
• ABSTRACT11-16
• 英文缩略词表16-20
• 第一章 绪论20-38
• 1.1 宏基因组学21-22
• 1.2 病毒宏基因组学概念的提出22-23
• 1.3 病毒宏基因组学的研究策略23-31
• 1.3.1 样品处理23-24
• 1.3.2 DNA文库的构建24-26
• 1.3.3 宏基因组文库的高通量测序26-29
• 1.3.4 病毒宏基因组学产生的数据分析29-31
• 1.4 国内外相关研究现状及发展趋势31-36
• 1.4.1 病毒群落的研究及新型病毒的鉴定31-33
• 1.4.2 病毒宏基因组学在病毒群落和新病毒发现上的应用33-36
• 1.5 研究目的与意义36-37
• 1.6 本研究的总体技术路线37-38
• 第二章 儿童及灵长类动物腹泻肠道病毒群落组成及比较38-78
• 2.1. 材料与方法38-51
• 2.1.1 研究样品的采集38-40
• 2.1.1.1 儿童粪便样品采集38-39
• 2.1.1.2 灵长类粪便样品采集39-40
• 2.1.2 重要试剂和酶类40-41
• 2.1.3 粪便样品的前处理41
• 2.1.4 粪便样品的核酸酶消化41-42
• 2.1.5 核酸的提取42-43
• 2.1.6. 样品组合设计43-44
• 2.1.7 反转录和双链DNA合成44
• 2.1.8 高通量测序文库的构建44-48
• 2.1.8.1 双链DNA的Tagmentation45-46
• 2.1.8.2 Index的添加及扩增、46-48
• 2.1.9 文库的纯化及DNA长度分布的优化48-49
• 2.1.9.1 文库中Index二聚体的去除48
• 2.1.9.2 文库DNA分布的优化48-49
• 2.1.10 文库质量检测49
• 2.1.11 将文库的Miseq深度测序49-50
• 2.1.12 深度测序结果的生物信息学分析50-51
• 2.2. 实验结果51-75
• 2.2.1 病毒宏基因组学深度测序DNA文库的质量检测51-53
• 2.2.1.1 文库DNA分布结果51
• 2.2.1.2 文库的Bioanalyzer检测结果51-53
• 2.2.2 Miseq测序结果53-55
• 2.2.3 病毒宏基因组学分析结果55-75
• 2.2.3.1 儿童肠道病毒群落55-64
• 2.2.3.2 灵长类动物病毒群落的组成64-70
• 2.2.3.3 儿童与灵长类动物肠道病毒群落的比较70-72
• 2.2.3.4 儿童及灵长类动物腹泻组与健康对照组肠道病毒群落比较72-75
• 2.3. 讨论75-78
• 第三章 儿童及灵长类动物群体病毒腹泻相关遗传关系分析78-124
• 3.1. 材料与方法79-91
• 3.1.1 粪便样品及处理79
• 3.1.2 病毒核酸的提取79-80
• 3.1.3 RNA病毒核酸的逆转录80-81
• 3.1.4 腹泻相关及新型病毒PCR检测引物81-86
• 3.1.4.1 基于本研究中发现的病毒基因序列的特异性引物设计如下表81-82
• 3.1.4.2 新型腺病毒基因组测序所用引物82-86
• 3.1.5 特定病毒的PCR检测86-88
• 3.1.5.1 PCR反应体系86
• 3.1.5.2 PCR反应参数86-87
• 3.1.5.3 PCR产物的电泳检测87
• 3.1.5.4 PCR反应产物的回收与纯化87-88
• 3.1.6 特定病毒目的基因的克隆测序88-89
• 3.1.6.1 PCR产物的T/A连接88
• 3.1.6.2 细菌感受态细胞的制备88-89
• 3.1.6.3 连接产物转化感受态细菌及培养89
• 3.1.7 病毒全基因组的de novo assembly89-90
• 3.1.8 基于病毒基因组或蛋白质序列的系统进化分析90-91
• 3.1.8.1 序列检索及筛选90
• 3.1.8.2 系统进化分析90-91
• 3.1.9 病毒基因组重组研究91
• 3.2. 结果91-121
• 3.2.1 星状病毒(Astroviridae)91-97
• 3.2.1.1 本研究中星状病毒的基因组结构分析92-94
• 3.2.1.2 本研究中3株星状病毒的遗传关系94-97
• 3.2.2 杯状病毒科97-101
• 3.2.2.1 札幌病毒(Sapovirus)97-99
• 3.2.2.2 诺如病毒(Norovirus)99-101
• 3.2.3 Picornaviridae与Picobirnaviridae101-103
• 3.2.4 戊型肝炎病毒样新型病毒(Hepeliviridae)103-110
• 3.2.5 圆环病毒及圆环病毒样病毒110-112
• 3.2.6 腺病毒(Adenovirus)112-121
• 3.2.6.1 新型腺病毒的基因组结构113-115
• 3.2.6.2 新型腺病毒与其他人及灵长类动物腺病毒的遗传关系115-119
• 3.2.6.3 基于基因组水平的病毒重组分析119-120
• 3.2.6.4 基因腺病毒基因序列的特异性引物检测120-121
• 3.3. 讨论121-124
• 第四章 主要结论与展望124-126
• 4.1 主要结论及创新点124-125
• 4.2 展望125-126
• 参考文献126-144
• 致谢144-145
• 在学期间发表的学术论文及其他科研成果145-146
• 学术论文145
• 主持、参与课题145-146
• 获奖及专利授权情况146

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本文编号：1060801