水飞蓟壳中水飞蓟素分离纯化及其功能性的研究

发布时间：2017-10-31 08:08

  本文关键词：水飞蓟壳中水飞蓟素分离纯化及其功能性的研究

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【摘要】：水飞蓟属于菊科植物,在水飞蓟的植株以及种子中含有一种天然黄酮类化合物,其中在种子中含量最高。近些年,在实验室中对水飞蓟素的研究主要在于研究水飞蓟素的主要单体化合物水飞蓟宾的分离纯化以及生理活性,但是对于其他单体化合物特别是如水飞蓟亭,水飞蓟宁等研究比较少,同时,在近些年的研究中水飞蓟素的提取工艺常用溶剂提取法,提取需要溶剂多,成本非常高,同时对环境的污染大,并且对于水飞蓟素的生理功能研究主要集中以水飞蓟素的对于肝脏系统的保护功能为研究热点,对其他功能活性研究非常少。以上的这些问题都在工艺技术以及生理活性的研究上阻碍了水飞蓟素的发展,所以,在水飞蓟素研究方面建立方便快捷的提取方式和分离纯化方式,以及完善在其他生理活性方面的研究具有非常重要的实际意义。主要结论如下：1、对水飞蓟壳中的水飞蓟素进行酶法辅助提取,水飞蓟素最佳提取条件,应用纤维素酶法辅助提取水飞蓟壳中水飞蓟素,酶浓度为30U/mL、酶解温度为45℃、酶解时间为12Omin、pH值为4.5,灭酶后,回流提取1h,水飞蓟素提取率为7.86%,比相同时间内传统溶剂提取法提取率提高了74.67%。2、应用HPD-600型大孔吸附树脂和200-400目硅胶分离纯化水飞蓟素中的主要单体化合物,分别用70%乙醇溶液和石油醚-丙酮溶液洗脱,用红外光谱、液相色谱-质谱串联技术(LC-MS)和核磁共振谱鉴定水飞蓟素单体的结构,结果如下：石油醚-丙酮2：1部分洗脱出1个黄酮类化合物,经鉴定为花旗松素,从石油醚-丙酮1：1部分洗脱出1个黄酮类化合物,经鉴定为水飞蓟宁,石油醚-丙酮1：2部分洗脱出3个黄酮类化合物,经鉴别分别是水飞蓟宾和水飞蓟亭。3、水飞蓟素在体内和体外的抗氧化活性进行研究,再体外抗氧化试验结果中表示,在超氧阴离子自由基清除率、羟基自由基清除率等不同的清除自由基实验中,水飞蓟亭与水飞蓟宁的清除自由基活性都是最高的,水飞蓟宾的抗氧化活性相比下比较低。在体内抗氧化试验过程中,水飞蓟素各剂量的血清T-SOD、肝脏T-SOD、血清T-AOC、肝脏T-AOC、血清CAT活性、肝脏CAT活性、血清GSH-Px口肝脏GSH-Px含量逐渐上升,而血清MDA和肝脏MDA含量随着试验周期的变化逐渐下降,试验结果显示：各个剂量的水飞蓟素可提高抗氧化酶类在血清和肝脏中的含量和活性,通过减少过氧化物在生成来提高抗氧化活性。4、水飞蓟素免疫调节活性研究,试验结束时,各剂量组的肝脏ACP活性、血清ACP活性、溶菌酶活性、一氧化氮含量、脾指数、摊廓清指数、吞噬指数和胸腺指数随着试验周期的延长逐渐升高,且呈剂量依赖型增长。试验结果表明：水飞蓟素高剂量组能提高脾指数和胸腺指数、血液ACP活性、肝脏的ACP活性以及溶菌酶的含量,从而增强吞噬细胞对其他物质的吞噬和吸收的能力,而且水飞蓟素高剂量组能显著提高小鼠的碳廓清指数(K)和吞噬系数(Q),所以,水飞蓟素高剂量组能够增强生物机体的非特异性免疫机能；水飞蓟素高剂量组能够提高血液中一氧化氮的含量,表明水飞蓟素可通过活化巨噬细胞进行免疫活动。5、水飞蓟素抗疲劳活性研究,试验结束时,与对照组相比,各剂量组小鼠实验体重和各器官重量无显著性差异(P0.05),在抗疲劳试验过程中,各剂量组水飞蓟素小鼠的爬杆时间、力竭游泳时间、肝糖原和肌糖原含量逐渐升高,而血乳酸BLA和血清尿素氮BUN含量逐渐减低,同时,水飞蓟素对小鼠肝脏(AST,ALT和白蛋白),胆管功能(ALP和总胆红素),心脏健康量表(LDH),肌肉功能(CK),肾功能(肌酐和尿酸),营养状况(总蛋白),和血脂水平(TC和TG)没有显著的副作用。通过对以上分析,水飞蓟素对小鼠的运动过程中的疲劳过程起到了十分有利的作用,抗疲劳损伤效果十分显著,表明对于肌细胞长时间的运动损伤具有保护作用,并且可以升高相关酶活性和运动小鼠骨骼肌内的能量代谢,促进细胞中的有氧代谢。并且以水飞蓟素高剂量组产生的抗疲劳作用效果最好。运动前后的石蜡切片显示,水飞蓟素对于小鼠心肌和骨骼肌由于长时间运动所导致的细微结构的损伤具有减轻的作用。但是对于水飞蓟素能够缓解疲劳的机理还不是十分明确,需要进行更加深入的研究。
【关键词】：水飞蓟 水飞蓟素 提取 分离纯化 生物活性
【学位授予单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R284.2
【目录】：

• 摘要13-15
• Abstract15-18
• 第一章 前言18-29
• 1.1 水飞蓟概述18-20
• 1.1.1 水飞蓟的植物形态18
• 1.1.2 水飞蓟资源概况18
• 1.1.3 水飞蓟的化学成分18-19
• 1.1.4 水飞蓟素在种籽的分布19-20
• 1.2 国内外研究现状20
• 1.2.1 国外研究现状20
• 1.2.2 国内利用现状20
• 1.3 植物有效成分的提取分离和分析20-22
• 1.3.1 提取分离的传统方法21
• 1.3.2 提取分离的新技术21-22
• 1.4 植物有效成分分离纯化方法22-24
• 1.4.1 柱层析法22-23
• 1.4.2 高速逆流色谱分离技术23-24
• 1.4.3 制备型高效液相色谱分离技术24
• 1.4.4 其它方法24
• 1.5 植物有效成分的结构鉴定24-25
• 1.5.1 红外光谱(IR)24
• 1.5.2 紫外光谱(UV)24-25
• 1.5.3 核磁共振谱(NMR)25
• 1.5.4 质谱(MS)25
• 1.6 水飞蓟有效成分的生物活性研究25-27
• 1.6.1 保肝作用25-26
• 1.6.2 抗肿瘤作用26
• 1.6.3 抗炎作用26
• 1.6.4 降血脂和抗动脉硬化26
• 1.6.5 防治糖尿病、肾病26-27
• 1.6.6 防治心脑血管疾病27
• 1.6.7 保护心肌作用27
• 1.7 本课题的目的、意义及主要研究内容27-29
• 1.7.1 研究的目的和意义27-28
• 1.7.2 主要研究内容28-29
• 第二章 酶法辅助提取水飞蓟素工艺研究29-41
• 2.1 试验材料与仪器29-30
• 2.1.1 材料与试剂29
• 2.1.2 主要仪器29-30
• 2.2 试验方法30-32
• 2.2.1 水飞蓟素的制备30
• 2.2.2 水飞蓟素提取率的测定30
• 2.2.3 水飞蓟素提取率的计算30-31
• 2.2.4 酶法辅助提取水飞蓟素单因素试验31-32
• 2.3 实验结果与分析32-39
• 2.3.1 单因素试验分析32-34
• 2.3.2 响应面优化实验结果分析34-37
• 2.3.3 酶法辅助提取电镜扫描37-39
• 2.4 讨论39-40
• 2.5 本章小结40-41
• 第三章 水飞蓟素的分离纯化研究41-56
• 3.1 试验材料与仪器41-42
• 3.1.1 材料与试剂41
• 3.1.2 主要仪器41-42
• 3.2 试验方法42-46
• 3.2.1 水飞蓟素样品溶液的制备42
• 3.2.2 树脂的选择42
• 3.2.3 不同型号大孔树脂的预处理与装柱42-43
• 3.2.4 大孔树脂的筛选43
• 3.2.5 大孔树脂柱吸附分离水飞蓟素条件优化43-45
• 3.2.6 硅胶柱层析分离水飞蓟素45-46
• 3.3 实验结果与分析46-53
• 3.3.1 不同型号大孔树脂的静态吸附和解吸性能46-47
• 3.3.2 不同型号树脂对水飞蓟素的静态吸附动力学47
• 3.3.3 不同型号大孔树脂对水飞蓟素的静态解吸附动力学47-48
• 3.3.4 HPD-600大孔树脂柱吸附分离水飞蓟素的条件优化48-51
• 3.3.5 硅胶柱层析分离水飞蓟素试验结果51-53
• 3.4 讨论53-54
• 3.5 结论54-56
• 第四章 水飞蓟素单体化合物的结构鉴定56-66
• 4.1 材料与方法56
• 4.1.1 材料与试剂56
• 4.1.2 实验仪器56
• 4.2 试验方法56-57
• 4.2.1 颜色反应定性研究水飞蓟素56-57
• 4.2.2 水飞蓟素单体化合物红外光谱测定57
• 4.2.3 水飞蓟素单体化合物质谱测定57
• 4.2.4 水飞蓟素单体化合物核磁共振波谱测定57
• 4.3 结果与分析57-64
• 4.3.1 颜色反应57-58
• 4.3.2 化合物Ⅰ的结构鉴定58-59
• 4.3.3 化合物Ⅱ的结构鉴定59-60
• 4.3.4 化合物Ⅲ的结构鉴定60-62
• 4.3.5 化合物Ⅳ的结构鉴定62-64
• 4.4 讨论64
• 4.5 本章小结64-66
• 第五章 水飞蓟素抗氧化活性的研究66-80
• 5.1 试验材料和方法66-67
• 5.1.1 试验材料66
• 5.1.2 试验仪器66-67
• 5.2 体外抗氧化试验方法67-68
• 5.2.1 总抗氧化能力的测定67
• 5.2.2 清除DPPH自由基能力的测定67
• 5.2.3 对超氧负离子(O_2~-)的清除作用67-68
• 5.2.4 清除·OH的测定方法68
• 5.3 体内抗氧化试验方法68-69
• 5.3.1 试验设计与试验方案68
• 5.3.2 检测指标及方法68
• 5.3.3 数据处理68-69
• 5.4 试验结果和分析69-77
• 5.4.1 水飞蓟素体外抗氧化活性69-71
• 5.4.2 水飞蓟素体内抗氧化活性71-77
• 5.5 讨论77-79
• 5.6 本章小结79-80
• 第六章 水飞蓟素免疫调节功能性的研究80-88
• 6.1 试验材料和方法80-81
• 6.1.1 试验材料80
• 6.1.2 试验仪器80
• 6.1.3 试验方法80-81
• 6.1.4 对免疫器官指数的影响81
• 6.1.5 水飞蓟素对非特异性免疫机能的影响81
• 6.1.6 数据处理81
• 6.2 试验结果和分析81-86
• 6.2.1 水飞蓟素对免疫器官指数的影响81-82
• 6.2.2 水飞蓟素对血清和肝组织ACP活性的影响82-84
• 6.2.3 水飞蓟素对巨噬细胞吞噬功能的影响84-85
• 6.2.4 水飞蓟素对血清中溶菌酶含量的影响85
• 6.2.5 水飞蓟素对外周血淋巴细胞一氧化氮(nitric oxide,NO)含量的影响85-86
• 6.3 讨论86-87
• 6.4 本章小结87-88
• 第七章 水飞蓟素抗疲劳活性研究88-102
• 7.1 实验材料与仪器88-90
• 7.1.1 材料与试剂88-89
• 7.1.2 试验仪器89
• 7.1.3 试验方法89
• 7.1.4 动物爬竿实验89
• 7.1.5 负重游泳实验及力竭游泳时间的测定89-90
• 7.1.6 检测指标及方法90
• 7.1.7 数据分析90
• 7.2 实验结果与分析90-100
• 7.2.1 水飞蓟素对小鼠体重的影响90
• 7.2.2 水飞蓟素对小鼠爬竿时间的影响90-91
• 7.2.3 水飞蓟素对小鼠负重游泳时间的影响91
• 7.2.4 水飞蓟素对小鼠血清尿素氮(BUN)和血乳酸(BLA)的影响91-92
• 7.2.5 水飞蓟素对小鼠肝糖原(LG)和肌糖原(MG)的影响92-94
• 7.2.6 水飞蓟素对运动后氨、血糖和血浆肌酸激酶水平的影响94-96
• 7.2.7 水飞蓟素对临床生化指标的影响96-97
• 7.2.8 在耐力运动中水飞蓟素的保护作用97-100
• 7.3 讨论100-101
• 7.4 本章小结101-102
• 第八章 结论102-105
• 参考文献105-114
• 附录114-122
• 致谢122-123
• 攻读博士期间发表的学术论文123-124

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前6条

1 方艳夕;朱金坤;;杭菊中黄酮苷的提取与分离[J];安徽科技学院学报;2006年02期

2 刘笃宽;水飞蓟的药理与临床研究概况(综述)[J];陕西中医;1984年04期

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5 黄雄,李萍,张重义,李会军;HPLC同时分析金银花中绿原酸和黄酮类成分的方法建立及其应用[J];中国药学杂志;2005年10期

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本文编号：1121485