基于全基因组测序及外显子组测序的食管癌相关基因筛选及功能鉴定

发布时间：2017-11-08 08:06

  本文关键词：基于全基因组测序及外显子组测序的食管癌相关基因筛选及功能鉴定

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【摘要】：目的从基因组学水平系统分析与食管鳞癌发生发展相关的单核苷酸变异、拷贝数扩增/缺失及结构变异等各类遗传变异,绘制相应的食管癌基因组图谱及食管癌相关基因变异图谱,探索与食管鳞癌发生发展密切相关的驱动基因及相应信号调控网络;并在此基础上,对兴趣目的基因进行相应的生物学功能验证,研究目的基因在食管癌细胞与正常食管粘膜上皮细胞中的表达差异;明确目的基因野生型与突变体的定位是否有区别;探讨沉默及过表达目的基因对食管癌细胞增殖、侵袭及迁移能力的影响;并初步探讨其在食管鳞癌中的作用机制。方法:1、收集104例食管鳞癌患者的癌组织及配对癌旁正常组织样本,提取基因组DNA,14例进行全基因组测序,90例进行外显子组测序,对测序结果进行目标区域捕获测序验证。应用生物信息学方法分析各类遗传变异,鉴定与食管鳞癌发生密切相关的显著突变基因及富集的信号通路,并进行Ⅰ、Ⅲ期差异比较分析。2、采用PCR sanger测序验证组学测序结果中ZNF750基因的突变位点;采用q-PCR分别验证及检测ZNF750在3例全基因组测序样本及6例外显子组突变样本中的拷贝数情况。3、采用基于组织芯片的免疫组织化学技术研究食管鳞癌组织及正常食管粘膜组织中ZNF750蛋白表达量及表达部位的差异。4、应用免疫荧光技术检测野生型ZNF750与S70X突变体的细胞内定位。5、(1)在内源性高表达ZNF750的KYSE150及KYSE140食管癌细胞中转染p LKO.1-puro-sh RNA-ZNF750载体,敲低内源性ZNF750,通过MTT实验、RTCA细胞实时分析实验、平板克隆形成实验在细胞水平观察该基因的敲低对食管鳞癌细胞增殖、侵袭及迁移能力的影响。(2)将ZNF750敲低前后的KYSE150细胞分别接种于裸鼠皮下,接种3-4周后观察和记录肿瘤形成数量和形成体积,在动物水平观察该基因的敲低对食管鳞癌细胞生物学特性的影响。6、将ZNF750的过表达载体转染内源性ZNF750低表达的K2细胞株,Western blot验证过表达效率;通过MTT实验、平板克隆形成实验及Transwell小室在细胞水平验证该基因的过表达对食管鳞癌细胞生物学功能的影响。7、采用Western blot方法观察ZNF750敲低前后的食管鳞癌细胞株以及裸鼠移植瘤的肿瘤样本中ZNF750已知的下游靶基因的表达情况,初步探讨ZNF750在ESCC中的作用机制。结果:1、基因编码区的变异分析发现了10330个突变事件,其中有10056个SNVs(67%为错义突变,6%为无义突变)、90个In Dels(84%为移码突变,16%为非移码突变)及184个位于剪切位点的变异;总共发生非沉默突变事件7597次。2、14例全基因组测序及90例外显子组测序中位于基因编码区的体细胞突变碱基替换类型以CT的转换为主,其次为CG的颠换。生物信息学方法的聚类分析鉴定了3种“突变频谱印迹”(mutational signatures)。3、运用Mut Sig排除基因长度、背景突变率的影响,并通过整合突变异质性,鉴定出8个可能与食管鳞癌相关的显著突变基因及14条食管鳞癌显著相关的信号通路。其中,ZNF750是新的食管鳞癌相关的显著突变基因(P0.0001,FDR0.178),其在组学测序中的突变64%为失活突变,且在3例全基因组测序样本中存在明显的拷贝数缺失(21%,G score0.23)。4、组学测序结果显示NOTCH1基因在Ⅰ、Ⅲ期的突变频率分别为35%、8%,其突变频率在Ⅰ、Ⅲ期之间有显著差异(P0.0001)。同时,鉴定出Ⅰ、Ⅲ期突变频率有显著差异的7条信号通路。5、拷贝数变异分析发现,在染色体臂水平,拷贝数缺失主要位于4p、11p、16p、19p、19q;拷贝数扩增主要位于3q、5p、7p、7q、8p、8q、12p、14q、18p、20q、21q、Xp、Xq。应用GISTIC分析,得出126个拷贝数显著变化的区域。6、应用CREST进行结构变异分析,我们发现了988次结构变异事件,其中染色体间的结构变异257次,染色体内部的结构变异296次,大片段的拷贝数缺失27次,大片段的插入163次,倒位2次。7、组学测序结果中ZNF750基因的6个突变位点中有5个突变位点成功验证,其中1个突变位点通过IGV的手工检测确定其为阳性结果;3例全基因组测序样本中的ZNF750拷贝数缺失均验证成功,6例ZNF750突变病例经q PCR验证有4例存在拷贝数缺失。8、肿瘤组织中胞浆ZNF750蛋白的表达量显著高于癌旁正常组织,而肿瘤组织中胞核ZNF750蛋白的表达量显著低于癌旁正常组织(P0.0001)。9、野生型ZNF750蛋白主要定位于细胞核;而S70X突变体定位于胞浆。10、(1)KYSE150及KYSE140细胞中ZNF750的敲低明显促进了癌细胞的增殖、侵袭及迁移(P0.05);(2)裸鼠移植瘤实验显示ZNF750敲低组的肿瘤形成率及肿瘤形成体积均明显高于对照组(P0.05)。11、K2中ZNF750基因的过表达明显抑制癌细胞的增殖、侵袭及迁移(P0.05),验证了ZNF750在食管鳞癌中肿瘤抑制基因的作用。12、KYSE150及KYSE140食管鳞癌细胞中ZNF750的敲低降低了KLF4的蛋白表达水平;ZNF750敲低组的裸鼠移植瘤的肿瘤样本中KLF4的表达水平与对照组相比,亦明显降低。结论:1、利用全基因组测序及外显子组测序筛选出了食管鳞癌相关的各类遗传变异,包括单核苷酸变异、拷贝数扩增/缺失及结构变异,应用目标区域捕获测序进行了相应的验证;筛选出ZNF750基因在食管鳞癌存在显著的失活突变及拷贝数缺失,其可能与食管鳞癌的发生发展密切相关。2、ZNF750基因可能是与食管鳞状细胞癌发生密切相关的新的肿瘤抑制基因,其抑制食管癌细胞增殖、侵袭、迁移的作用可能通过KLF4实现
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.1

【参考文献】

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本文编号：1156287