转录因子KLF9在卵巢癌中的生物学功能和机制研究

发布时间：2017-11-08 09:37

  本文关键词：转录因子KLF9在卵巢癌中的生物学功能和机制研究

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【摘要】：研究背景卵巢癌是妇科肿瘤中病死率最高的肿瘤,也是女性肿瘤疾病中最常见的一种,综合发病率位列众多女性易患癌症第三位,仅次于宫颈癌和子宫内膜癌。90%-95%的卵巢癌都为卵巢原发性癌,其余则往往是由其他部位癌症转移引起的恶性肿瘤。卵巢癌患者的五年存活率仅有25%-30%。因此,卵巢癌相较宫颈癌和子宫内膜癌的发病率更低,但死亡率却更高,其死亡率甚至超过了宫颈癌与子宫内膜癌之和,是威胁女性健康的最大杀手。转录因子是存在于细胞核内的一种具有序列特异性DNA结合能力的蛋白,可以通过激活或者抑制靶基因的转录,调控下游基因在细胞和组织中的时空特异性表达。在个体细胞生长、分化、增殖、凋亡及胚胎发育等各种生理生化过程中发挥着十分重要的角色。转录因子在肿瘤中通常呈现出不同于正常细胞的表达方式,在肿瘤的发生发展中发挥着重要的作用。Kruppel样转录因子(Kruppel-like transcription factors, KLFs)是真核细胞中广泛存在一类锌指DNA结合蛋白。根据锌指结构的特征,又可以细分为C2H2(two cysteine and two histidine amino acid residues, Cys2/His2)型、C3H4型和C4H4型等。人类基因组中存在700多个含有Cys2/His2锌指结构的转录因子,KLFs就属于这类转录因子。目前已发现至少20种KLFs,他们可以结合到靶基因启动子区的GC/CACC box和GT/CACC box调控靶标基因的转录。研究表明,KLF家族转录因子在肿瘤中发挥着重要的作用,并且不同的KLF在不同类型的肿瘤中发挥作用。例如,KLF5在结肠癌、肺癌中的表达显著升高,并具有促进肿瘤细胞增殖的作用,而KLF4在胃癌、肝癌中的表达显著降低,提示其可能在这两种肿瘤中作为一种抑癌基因发挥功能。KLF9为KLF家族中的重要成员之一,其作用机制主要通过激活或抑制富含GC box的启动子来调控基因的表达。人KLF9基因位于染色体9q13,基因结构包含2个外显子,其CDS编码区长达735 bp,编码144个氨基酸残基组成的多肽链。KLF基因结构,羧基末端含3个经典且高度保守的Cys2/His2锌指结构,氨基酸位置为143-167,173-197,203-225位,氨基末端富含有天冬氨酸/谷氨酸(Asp/Glu),即酸性氨基酸。结合DNA依靠位于羧基末端的3个保守的锌指结构,可以结合到核酸的大沟,从残基而调节靶基因的转录[11]。人的KLF9和大鼠KLF9的氨基酸序列相似度高达98%,说明该蛋白在哺乳动物中具有较高的序列保守性。同KLF家族内部的其他众多成员相比,KLF9具有家族保守的羧基末端DNA结合结构域,而氨基末端结构则呈现出较大的差异,这种差异可能导致了KLF家族成员转录活性的差异。KLF9肽链羧基末端含有3个串联/相邻的Cys2/His2锌指的保守DNA结合结构域,这3个串连的锌指结构也决定了KLF9的DNA结合能力,它们通过结合到DNA的大沟部位来调节靶基因的转录,其氨基端富含Asp/Glu等酸性氨基酸残基,这一结构的存在可能与蛋白质-蛋白质相互作用相关。KLF9可激活含有多个GC box基因的启动子,但对含有一个GC box基因的启动子却有抑制作用。对绝大多数靶基因而言,KLF9能激活靶基因的表达,但是对个别基因却起着抑制其表达的作用。KLF9具有保守的羧基末端DNA结合结构域,这一点与其他KLF家族成员相似,然而氨基末端结构在各成员之间则变化较大,这可能决定了KLF家族成员转录活性的差异。研究发现,KLF9基因敲除小鼠能够在饲养环境下正常生长,且外部表型与野生型小鼠无异。但雌性KLF9-/-小鼠与野生型相比,其生殖系统结构和功能明显受影响,表现为子宫发育不良和生殖能力低下,比如胚胎植入数目和产仔数下降以及新生仔鼠死亡率增加等。这些现象的出现主要是Ax1、Cyclin D1、LPI、Hoxa10、PR等KLF9的下游基因异常表达有关。鉴于KLF9在细胞生长、增殖、细胞周期等核心生物学过程中具有重要作用,而这些这些生命活动的异常与肿瘤有紧密联系,据此我们推测KLF9可能参与肿瘤的发生发展过程。第一部分KLF9在卵巢癌中的表达及相关检测实验目的：通过检测KLF9在卵巢癌组织和癌旁正常组织中的mRNA的水平和蛋白表达情况,探索卵巢癌发病与KLF9表达的相关性。实验方法：随机收集20对手术切除的卵巢癌组织以及癌旁正常组织。首先我们提取了这些组织的mRNA,利用KLF9特异性引物,进行了荧光实时定量聚合酶链反应实验,分析卵巢癌组织以及癌旁正常组织的]mRNA的表达含量差异。我们随机选取了3例卵巢癌组织及其癌旁组织,利用KLF9特异性抗体,采用免疫印迹法,检测卵巢癌组织以及癌旁正常组织的KLF9蛋白表达情况。实验结果：1.我们发现与癌旁组织相比,KLF9的mRNA水平在卵巢癌组织中显著升高。2.在免疫印迹实验中,我们发现卵巢癌组织的KLF9的蛋白水平显著高于癌旁正常组织,这一结果与KLF9在卵巢癌组织中的mRNA高表达一致。因此,以上结果表明,KLF9在卵巢癌组织中高表达。实验结论：1.与癌旁组织比较,卵巢癌组织中KLF9的mRNA水平显著升高。2.卵巢癌组织中的KLF9的蛋白表达水平显著高于癌旁正常组织。3.这一结果提示我们KLF9在卵巢癌中发生发展中起到了一定的作用。我们推测KLF9参与了卵巢癌的发生发展。第二部分KLF9在卵巢癌发生发展中的生物学功能研究实验目的：通过在卵巢癌细胞株中分别过表达和干扰表达KLF9基因,检测细胞的活力、增殖和细胞周期进程等,进而通过检测细胞周期相关基因的表达,以探讨KLF9在在卵巢癌病理生理过程中的作用及分子机制。最后结合裸鼠荷瘤实验,将卵巢癌细胞中KLF9干扰表达后,检测小鼠肿瘤的形成和生长,以判断KLF9是否可以作为卵巢癌干预和治疗的有效靶点。实验方法：1.构建了KLF9的过表达质粒,转染卵巢癌细胞株SKOV3。KLF9过表达后,通过MTT和BrdU掺入实验检测,SKOV3细胞活力及增殖能力。同时选取另一种卵巢癌细胞株OVCAR3细胞。2.给予卵巢癌细胞转染KLF9的慢病毒,用于干扰SKOV3细胞内源性KLF9的表达。检测细胞活力及其增殖能力。进而,流式细胞分选实验测细胞周期。同时取卵巢癌OVCAR3细胞进行实验。3.通过实时定量PCR(Real-time PCR),检测与细胞增殖密切相关的基因。在KLF9过表达的SKOV3细胞中,检测mRNA在Cyclin D1、Cyclin A、Cyclin B1、 Cyclin E、P21、P27等细胞周期调控蛋白的值变化。蛋白印迹实验检测KLF9对Cyclin D1的调控作用。过表达的OVCAR3细胞,也检测其Cyclin D1的表达。再测KLF9干扰表达的两种卵巢癌细胞中,Cyclin D1的mRNA和蛋白水平。检测Cyclin D1干扰表达后,卵巢癌细胞活力和增殖。4.构建了-2000bp至+10bp的Cyclin D1启动子报告基因质粒,采用荧光素酶双报告基因实验,检测该启动子其活性。构建截断质粒(Truncation),检测-5000bp至-200bp的Cyclin D1启动子。运用生物信息学方法,在TESS网站上,检测该段启动子300个碱基。采用染色质免疫共沉淀实验检测KLF9与该段启动子结合后Cyclin D1 mRNA的转录表达。5.构建KLF9干扰表达的稳定转染细胞株,并注射裸鼠皮下,观察小鼠成瘤情况。5周后,杀死小鼠,测肿瘤直径、容积和重量对,对照组同测。同时检测KLF9干扰表达组及对照组的肿瘤细胞Cyclin D1的mRNA和蛋白水平。实验结果：1.KLF9的过表达具有促进卵巢癌细胞活力和增殖的作用。KLF9过表达后,通过MTT和BrdU掺入实验检测,SKOV3细胞活力和增殖能力显著增加。流式细胞分选实验表明,细胞周期加快,表现在G0-G1期细胞减少,S期细胞增加。另一种卵巢癌细胞株OVCAR3细胞得到了相同的结果。2.下调KLF9的表达将抑制卵巢癌细胞的增殖。转染KLF9的慢病毒卵巢癌细胞,其细胞活力和增殖能力显著降低。流式细胞分选实验表明其细胞周期减慢,表现在G0-G1期细胞增加,S期细胞减少。在OVCAR3细胞也得到相同结果。3.KLF9可能通过上调Cyclin D1的表达,促进细胞的增殖。通过实时定量PCR发现在KLF9过表达的SKOV3细胞中,Cyclin D1的mRNA表达显著增加,而Cyclin A、Cyclin B1、Cyclin E、P21、P27等细胞周期调控蛋白则无显著变化。蛋白印迹实验也进一步证实了KLF9对Cyclin D1的调控作用。在KLF9过表达的OVCAR3细胞,也观察到了Cyclin D1的高表达。而在KLF9干扰表达的两种卵巢癌细胞中,Cyclin D1的mRNA和蛋白水平均显著下调。因此,KLF9可能通过上调Cyclin D1的表达,明显逆转了KLF9对卵巢癌细胞活力和增殖的影响。因此,KLF9的生物学功能依赖Cyclin D1基因。4. Cyclin D1干扰表达可逆转KLF9的作用。KLF9过表达后,促进了该启动子的活性。5.KLF9调控Cyclin D1的分子机制为结合在cyclinD1的结合位点。分析了启动子的300个碱基。从中发现：-267bp处有一个可能的KLF结合位点。通过构建该位点的碱基突变质粒,表明：KLF9显著增加野生型Cyclin D1启动子的活性,而对碱基突变后的启动子无显著影响。进一步,染色质免疫共沉淀实验的结果证实：KLF9可以同该段启动子直接结合,进而促进了Cyclin D1 mRNA的转录和表达。6.干扰KLF9表达显著抑制裸鼠体内卵巢癌细胞的生长。观察小鼠的成瘤情况。KLF9干扰表达组,肿瘤直径、容积和重量均显著小于对照组。与此对应的是,KLF9干扰表达组肿瘤细胞Cyclin D1的mRNA和蛋白水平显著下调,进一步证实Cyclin D1是KLF9的下游靶基因。实验结论：1.KLF9过表达后,促进卵巢癌细胞的活力和增殖,加快细胞周期进程。2.KLF9干扰表达后,抑制卵巢癌细胞的活力和增殖,阻止细胞周期进程。3.KLF9通过结合在Cyclin D1基因的启动子上,促进Cyclin D1基因的转录和表达。4.干扰Cyclin D1基因的表达后,显著抑制KLF9促进肿瘤细胞增殖的作用。5.裸鼠成瘤实验进一步证实：KLF9在体内具有促进卵巢癌细胞增殖、肿瘤生长的作用。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.31

【参考文献】

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1 Amr M.GHALEB,Mandayam O.NANDAN,Sengthong CHANCHEVALAP,W.Brian DALTON,Irfan M.HISAMUDDIN,Vincent W.YANG;Krüppel-like factors 4 and 5:the yin and yang regulators of cellular proliferation[J];Cell Research;2005年02期

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本文编号：1156607