神经珠蛋白对心肌肥大、凋亡的影响及其机制的研究

发布时间：2017-11-09 14:21

  本文关键词：神经珠蛋白对心肌肥大、凋亡的影响及其机制的研究

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【摘要】：研究背景：神经珠蛋白(neuroglobin, Ngb)又叫作脑红蛋白,是一种主要表达于脑组织的携氧球蛋白,能够参与能量代谢、线粒体功能以及细胞生长和扩增的信号通路调节,并能维持神经元细胞氧稳态来应对氧化应激压力。最近的研究表明Ngb在心肌细胞中也有较高的表达,然而其在心肌细胞中的具体作用机制仍然不是很清楚。本研究以大鼠H9c2成肌细胞为体外细胞模型和大鼠为动物模型,研究Ngb在心肌肥大及心肌细胞凋亡中的作用及其机制。研究目的：1.研究神经珠蛋白对心肌肥大的影响；2.研究神经珠蛋白对心肌细胞凋亡的影响；3.研究神经珠蛋白调控心肌细胞凋亡的作用机制。研究方法用含不同浓度的异丙肾上腺素(isoproterenol, ISO) (OnM,10 nM,100 nM, 500 nM, 1μM)的培养基处理体外培养的大鼠H9c2成肌细胞12小时或者含有1μM异丙肾上腺素的培养基处理细胞0h,6h,12 h,18 h,24 h,36h后,用倒置相差显微镜观察H9c2成肌细胞的形态学变化；用MTT方法检测不同条件处理细胞后细胞的存活率；用Caspase-3还原酶试剂盒检测细胞酶活力变化情况,同时使用Western杂交检测Ngb及凋亡相关蛋白的表达量以及在细胞中的亚定位；并利用流式细胞术测定活性氧变化；流式细胞术PI单染法检测细胞周期以及Annexin v-FITC PI双染法检测凋亡细胞所占比例。最后,在H9c2成肌细胞上转染Ngb基因片段(过表达Ngb)或NgbshRNA(敲除Ngb),并观察细胞形态学变化及对成肌细胞凋亡的影响并探讨其作用机制。研究结果1.心肌细胞的死亡率(坏死、凋亡)、肥大细胞比例,随异丙肾上腺素药物浓度以及作用时间的增加而增加,存活细胞的比例先减少后期则有所回升。在异丙肾上腺素药物浓度为1gM和作用时间为12h时,心肌细胞的肥大比例和死亡率为最高。2.HE染色和免疫组化技术检测结果显示,用异丙肾上腺素药物处理后的大鼠心肌细胞出现明显的肥大,同时细胞中Ngb的表达显著上升。3.流式细胞术Annexin v-FITC PI双染法检测细胞结果显示细胞凋亡在Ngb降低表达的(shRNA)心肌细胞中最为明显,而在过表达Ngb的心肌细胞中最不明显。4. Western Blotting及实时荧光定量PCR(Quantitative RT-PCR,qPCR)检测p53、Bax、PUMA、NOXA、DR5、Scotin、Bcl-2表达情况,发现这些基因在Ngb降低表达的心肌细胞中的表达在蛋白和mRNA水平上显著升高,但在过表达Ngb的心肌细胞中表达在蛋白和mRNA水平上都显著降低,Bcl-2则相反。5.流式细胞术检测H9c2成肌细胞中活性氧的含量情况,结果显示其活性氧的含量在Ngb降低表达的心肌细胞中含量最高,但在过表达Ngb的细胞中含量最低。6.将细胞活性氧抑制剂(N-acetyl-cysteine, ROS scavengere, NAC)与异丙肾上腺素药物共同作用H9c2成肌细胞后与单独加入异丙肾上腺素相比,可见细胞内活性氧含量显著下降,所有组的H9c2细胞凋亡都明显减少,其相对数量与以上凋亡检测结果一致。说明ROS参与了凋亡的发生,且Ngb的作用与NAC相似,具有抗氧化作用。结论1.神经珠蛋白在大鼠心肌细胞中都有表达并能够显著抑制异丙肾上腺素诱导的心肌肥大。2.神经珠蛋白能通过调节细胞内活性氧含量和p53途径抑制异丙肾上腺素诱导的的心肌细胞凋亡,而p肾上腺素受体(p-AR)没有在其中发挥作用。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R54

【共引文献】

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本文编号：1162242