EZH2及其介导的STAT3甲基化在常染色体显性多囊肾病中的作用研究

发布时间：2017-12-05 18:28

  本文关键词：EZH2及其介导的STAT3甲基化在常染色体显性多囊肾病中的作用研究

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【摘要】：研究背景及目的常染色体显性多囊肾病(ADPKD)是由单基因突变引起的遗传性肾脏疾病,也是最常见的遗传性肾病。它主要由PKD1或PKD2基因突变引起。其主要病理特点是肾囊肿形成,并逐渐增大压迫替代正常肾组织引起肾功能恶化,最终导致肾衰竭。ADPKD患病率为1-2.5‰,通常发生在30岁至40岁,约占终末期肾病患者病因8-10%。近年来多囊肾病的研究取得一定进展,但目前尚无有效的逆转其进程的治疗方法。研究发现起源于正常肾小管上皮细胞的囊肿衬里上皮细胞不断增殖、去分化是多囊肾病发生和发展的关键因素,这与良性肿瘤的增殖有许多相似之处。Enhancer of zeste homolog 2(EZH2)是一种组蛋白赖氨酸甲基转移酶,能够催化组蛋白H3第27赖氨酸三甲基化,参与众多生命过程。研究发现EZH2在多种实体肿瘤中高表达,如肺癌、膀胱癌、卵巢癌,已经成为肿瘤治疗的热点和新靶点。EZH2介导的非组蛋白甲基化是十分重要的翻译后修饰,参与许多生命过程,如细胞周期、DNA修复、细胞衰老、分化、凋亡和肿瘤发生。我们实验室前期分析芯片数据,结果显示在大鼠多囊肾组织中EZH2高表达,其表达随大鼠周龄增加而增加,提示EZH2可能在多囊肾病中起作用。目前,国内外尚无多囊肾病与EZH2关系的报道,EZH2在多囊肾病中的作用尚待研究。本研究拟从细胞、组织、器官及整体水平,探索EZH2作为多囊肾病治疗新靶点的的价值,研究EZH2介导的STAT3甲基化在多囊肾病发病中的作用和机制,从而为多囊肾病寻找新的治疗靶点提供理论基础和实验依据。内容主要分以下4部分。第一部分EZH2在多囊肾组织中的表达和活性目的:明确EZH2在人、鼠多囊肾组织中的表达情况方法:收集人多囊肾组织及正常对照肾组织标本、Pkd1敲除小鼠及野生型小鼠肾组织标本,运用PCR、Western Blot方法,检测EZH2在多囊肾组织中的表达,并通过检测其特异性底物组蛋白H3第27赖氨酸甲基化含量来反映EZH2活性。结果:EZH2 mRNA水平和蛋白水平在多囊肾病患者肾组织中均明显高于正常对照组,且酶活性升高;EZH2在Pkd1敲除小鼠多囊肾组织中的表达及活性显著高于野生型组。结论:EZH2在多囊肾组织中的表达和活性显著升高。第二部分 EZH2抑制剂对囊肿衬里上皮细胞增殖及pkd1敲除小鼠肾囊肿生长的作用及机制目的:观察EZH2选择性抑制剂gsk126对多囊肾病囊肿衬里上皮细胞增殖及pkd1敲除小鼠肾功能和肾囊肿的作用及机制。方法:应用EZH2选择性抑制剂gsk126处理对数期生长的多囊肾病囊肿衬里上皮细胞(wt9-12),用mtt法测定其对wt9-12细胞增殖的抑制作用,用ldh毒性释放实验检测gsk126对wt9-12细胞的毒性作用;采用pkd1敲除小鼠腹腔注射EZH2选择性抑制剂gsk126,3周后留取组织标本和血清,观察小鼠肾重/体重、血肌酐、血尿素氮等肾功能指标变化,探索EZH2作用多囊肾病新靶点的治疗作用;构建EZH2质粒、干扰rna,在wt9-12细胞中过表达和抑制EZH2,通过westernblot研究EZH2对多囊肾病囊肿衬里上皮细胞stat3活性的作用,并在pkd1敲除小鼠模型中验证。结果:EZH2选择性抑制剂gsk126抑制多囊肾病细胞增殖,且抑制增殖的药物浓度对细胞无毒性作用;EZH2选择性抑制剂gsk126延缓pkd1敲除小鼠囊肿增长,降低pkd1敲除小鼠肾重/体重,降低pkd1敲除小鼠血肌酐、血尿素氮水平,改善pkd1敲除小鼠肾功能;在囊肿衬里上皮细胞wt9-12中,通过质粒转染过表达EZH2引起stat3的活性增加,通过EZH2选择性抑制剂gsk126和(或)干扰rna下调EZH2表达,导致stat3磷酸化呈现浓度依赖性降低;EZH2选择性抑制剂gsk126抑制pkd1敲除小鼠肾组织中stat3活性。结论:EZH2抑制剂能够抑制囊肿衬里上皮细胞增殖,延缓pkd1敲除小鼠肾囊肿的进展,改善pkd1敲除小鼠肾功能,EZH2可能成为多囊肾病治疗的新靶点;EZH2通过调节stat3磷酸化活性参与影响多囊肾病的进展。第三部分过表达EZH2促进斑马鱼肾囊肿的形成目的:过表达EZH2观察其促进斑马鱼肾囊肿的形成。方法:利用pcs2-egfp作为载体,通过限制性内切酶bamhi/xhoi构建斑马鱼pcs2-EZH2-egfp质粒,将质粒利用noti线性化通过试剂盒转录合成EZH2全长mrna。通过显微注射在斑马鱼中过表达EZH2,观察过表达EZH2是否能够促进斑马鱼产生前肾囊肿。结果:过表达EZH2,部分斑马鱼出现前肾囊肿,比例为17.1%±9.8%,空白载体对照组斑马鱼无前肾囊肿产生。结论:EZH2参与并促进斑马鱼肾囊肿的形成。第四部EZH2及其介导的STAT3甲基化在多囊肾病发病机制中作用目的:探索EZH2在多囊肾病中表达增加的机制以及EZH2介导的STAT3甲基化在多囊肾病发病机制中的作用。方法:通过cAMP激活剂(Forskolin)、cAMP类似物(8-Br-camp)和竞争性抑制剂(Rp-camp)、PKA激活剂(H89)探索cAMP/PKA通路对EZH2在多囊肾病中表达和活性的影响;通过免疫共沉淀和Western blot探索在ADPKD中EZH2与STAT3是否能够直接结合、相互作用,在多囊肾病中STAT3的甲基化是否高表达;通过免疫共沉淀和Western blot探索EZH2选择性抑制剂GSK126能否抑制STAT3甲基化进而调节STAT3活性。结果:cAMP激活剂(Forsklin)、c AMP类似物(8-Br-camp)增加囊肿衬里上皮细胞WT9-12中EZH2的表达和活性,c AMP竞争性抑制剂(Rp-camp)、PKA激活剂(H89)下调WT9-12细胞中EZH2的表达和活性。在多囊肾病患者肾组织和WT9-12细胞中,EZH2均能与STAT3直接结合;在多囊肾病患者肾脏组织中STAT3甲基化高表达;EZH2选择性抑制剂GSK126抑制WT9-12细胞中STAT3甲基化,进而调节STAT3磷酸化活性。结论:在多囊肾病中EZH2的表达受c AMP/PKA通路的调节,EZH2调节STAT3甲基化,进而调节STAT3活性,在多囊肾病进展中起到重要作用。小结:
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R692.1

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本文编号：1255788