组蛋白甲基化修饰在维甲酸致神经管畸形发生中的作用及分子机制研究

发布时间：2017-12-06 08:08

  本文关键词：组蛋白甲基化修饰在维甲酸致神经管畸形发生中的作用及分子机制研究

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【摘要】：目的:神经管畸形(Neural tube defects,NTDs)是由神经管闭合障碍引起的一种常见的先天性出生缺陷疾病,严重影响了人口质量,但其病因复杂,发病机制尚不清楚,因此,深入研究NTDs的发病机制对于降低出生缺陷、提高人口质量意义重大。本研究的目的主要有:1揭示维甲酸(Retinoic acid,RA)诱导的NTDs鼠胚的转录组谱变化,筛选出NTDs相关的重要差异表达基因。2重点研究Hox基因在NTDs中的变化规律,探讨组蛋白H3K27me3甲基化修饰对Hox基因的调控作用,从表观遗传角度阐释环境因素影响NTDs发生的机制。另外,初步探讨Nr2e1基因在RA诱导的NTDs发生中的作用及机制。方法:1采用RNA-seq技术测定NTDs鼠胚转录组谱变化。1.1采用28mg/kg RA于小鼠胚胎7.5天(E7.5d)时对孕鼠进行灌胃构建NTDs鼠胚模型,对照组孕鼠采用同等剂量香油进行灌胃,分别于E8.5d、E9.5d和E10.5d分离鼠胚脑泡组织,采用Illumina HiSeqTM 2000测序平台进行转录组谱的测定。1.2采用RPKM法计算基因表达量,将FDR≤0.001且Log2Ratio≥1的基因定义为差异表达基因,并进行GO和KEGG pathway显著性富集分析,了解差异表达基因参与的生物学过程及信号代谢通路。1.3通过取交集的方法筛选出在E8.5d、E9.5d和E10.5d均为差异表达的基因,即与NTDs相关的差异表达基因,并通过RT-PCR和RT-qPCR对筛选基因进行表达量验证。2rna-seq测序数据中hox基因呈现整体上调,本研究将重点围绕显著差异表达的hox基因进行深入探讨。2.1采用rt-qpcr检测ra干预的ntds鼠胚脑泡组织及sv/129小鼠胚胎干细胞(escs)和c57bl/6鼠胚神经干细胞(nscs)中的hox基因mrna水平。2.2采用westernblot检测ra干预的ntds鼠胚脑泡组织及escs和nscs中的h3k27me3修饰水平。2.3采用rt-qpcr检测ra干预的ntds鼠胚脑泡组织及escs和nscs中的h3k27me3甲基化转移酶ezh2和去甲基化酶kdm6a和kdm6b的mrna水平。2.4采用chip-qpcr检测ra干预的escs中h3k27me3在hox基因启动子区的富集情况。2.5采用nanostring技术检测临床ntds标本中hox基因的表达情况,采用westernblot检测h3k27me3修饰水平。3对rna-seq数据中表达丰度最高、差异倍数最大的下调差异表达基因nr2e1的作用和机制进行初步探讨。3.1采用全胚胎原位杂交和rt-pcr技术对ra诱导的ntds鼠胚nr2e1基因时空表达模式进行检测。3.2通过集落形成、cck-8、流式细胞技术和免疫荧光等方法比较正常组和ntds组分离出的两种nscs的增殖和分化能力,并采用rt-pcr和westernblot技术检测nr2e1基因在两种nscs中的表达情况。3.3采用慢病毒作为nr2e1shrna的载体转染正常组nscs,通过集落形成计数和cck-8法检测nr2e1基因对nscs增殖的影响,通过免疫荧光法计数map2和gfap阳性细胞,检测nr2e1基因对nscs向神经元和星形胶质细胞分化的影响。结果:1ntds鼠胚转录组谱的变化情况。1.1brc8_5-vs-bra8_5检测到587个差异表达基因,上调296个,下调291个;brc9_5-vs-bra9_5检测到2256个差异表达基因,上调1782个,下调474个;brc10_5-vs-bra10_5检测到2337个差异表达基因,上调1464个,下调873个。1.2经过go功能性富集分析,发现差异表达基因主要与轴突、细胞连接、细胞膜及细胞外基质等细胞成分相关,与结合能力、通道活性及转运能力等分子功能相关,与组织器官发育过程、细胞发育、分化和迁移等生物学过程相关,但各时期差异表达基因富集的goterms略有不同。1.3经过keggpathway富集分析,发现差异表达基因主要参与轴突导向、基底细胞癌、细胞粘附分子、胆碱能突触、hedgehog信号通路、糖酵解/糖异生等pathway。1.4通过取交集的方法,筛选到了196个在3个时期均有差异表达的基因,根据基因表达模式大致分为2类,以上调为主的基因和以下调为主的基因。其中,上调基因主要参与识别、细胞分化和前/后轴模式特异化等生物学过程,而下调基因主要参与中枢神经系统(cns)发育、神经元分化、神经元产生、神经发生等生物学过程。1.5将差异倍数增加至20倍,筛选出了26个在ntds发生过程中呈现显著差异表达的基因,其中25个基因得到了rt-qpcr验证。2hox基因的h3k27me3调控通路在ntds发生中的作用。2.1在前期rna-seq测序数据中,筛选了10个差异倍数大于20倍的hox基因,其在ntds发生过程中较正常组鼠胚均呈现表达上调,并且这种变化趋势在ra干预的sv/129鼠escs和c57bl/6鼠nscs中得到了验证。2.2ra干预的escs和nscs中及鼠胚脑泡组织中均显示h3k27me3水平显著下降,进一步研究发现h3k27me3修饰水平降低是由甲基化转移酶ezh2表达降低而去甲基化酶kdm6b表达升高引起。2.3chip-qpcr结果显示,在ra干预下h3k27me3与10个hox基因的结合能力均减弱,即h3k27me3修饰水平发生降低,引起了下游hox基因的表达上调。2.4临床无脑畸形样本中的hox基因呈现整体上调,并且h3k27me3修饰水平发生下降,其中hoxc4和hoxd1表达与h3k27me3修饰水平呈现显著负相关性。3nr2e1在ra诱导的ntds发生中的作用。3.1全胚胎原位杂交结果显示,nr2e1主要表达在鼠胚前脑,正常发育过程中表达逐渐增高,而在ntds鼠胚中几乎没有变化;rt-pcr结果也显示nr2e1在ntds胚胎中的表达显著低于正常组。3.2集落计数和CCK-8结果显示正常组NSCs的增殖能力显著高于NTDs组NSCs;FCM结果表明NTDs组NSCs的细胞被捕获在了G1期,无法进入S期(即DNA合成期);免疫荧光结果表明NTDs组NSCs向神经元和星形胶质细胞分化的能力都显著低于正常组,说明NTDs组的NSCs是受损的细胞。RT-PCR和Western blot结果显示,Nr2e1在NTDs组NSCs中表达显著低于正常组NSCs。3.3 LV3-Nr2e1 shRNA转染NSCs,结果表明抑制Nr2e1表达显著降低了NSCs的增殖能力,并且使NSCs向神经元分化能力减弱,而向星形胶质细胞分化能力增强,即NSCs分化发生紊乱。结论:1 RA诱导的NTDs鼠胚转录组谱发生了显著变化,筛选出25个与NTDs相关的显著差异表达基因,其中10个Hox基因发生上调,Nr2e1基因表达丰度最高且下调倍数最明显。2 Hox基因在NTDs鼠胚中呈现整体表达上调趋势,其表达紊乱受到了H3K27me3的调控,并且这种Hox基因的表观遗传调控机制在临床无脑畸形的发生中具有重要作用,从组蛋白甲基化修饰角度为NTDs的发生提供新的表观遗传调控机制。3 Nr2e1基因表达下调,可引起NSCs增殖和分化障碍,参与RA诱导的NTDs发生。
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R748

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