羟氯喹对酪氨酸激酶抑制剂耐药慢性粒细胞白血病细胞的作用和机制研究

发布时间：2017-12-07 15:05

  本文关键词：羟氯喹对酪氨酸激酶抑制剂耐药慢性粒细胞白血病细胞的作用和机制研究

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【摘要】：第一章羟氯喹增强酪氨酸激酶抑制剂对T315I突变细胞的杀伤作用背景:T315I是最常见的BCR-ABL激酶区点突变,该突变造成BCR-ABL融合蛋白第315位苏氨酸被异亮氨酸取代,引起融合蛋白的构象和功能发生变化,是造成CML多药耐药的重要原因。带有BCR-ABLT3151突变的CML对伊马替尼、达沙替尼、尼罗替尼和博舒替尼等多种TKIs耐药,第三代TKIs-博纳替尼是目前治疗T315I突变CML的一线药物,另外有文献报道血管表皮生长因子受体抑制剂—阿西替尼也可以在体外杀伤T315I突变的CML细胞。在药物压力下肿瘤细胞可以通过"自噬"来维持细胞内稳态避免细胞凋亡,因此"自噬"是肿瘤细胞对抗药物杀伤的利器。伊马替尼通过抑制BCR-ABL的激酶活性在杀伤CML细胞的同时也诱导了 CML细胞自噬,自噬在一定程度上削弱了伊马替尼的杀伤作用。在伊马替尼治疗的同时,利用自噬抑制剂羟氯喹(HCQ)抑制CML细胞自噬可以显著增强伊马替尼的抗肿瘤作用。在T315I突变CML细胞中,阿西替尼、博纳替尼能否诱导细胞自噬,自噬是否为T315I突变CML细胞逃避药物杀伤的一种机制,自噬抑制剂羟氯喹(HCQ)能否增强阿西替尼、博纳替尼对T315I突变CML细胞的杀伤作用目前尚无报道。目的:研究自噬抑制剂—羟氯喹(HCQ)是否能够增强阿西替尼、博纳替尼对32Dp210-T315I细胞的杀伤,并进一步揭示HCQ的作用机制,为T315I突变CML的治疗提供思路和方向,为推动HCQ联合TKIs在耐药CML治疗中的应用奠定基础。方法:以稳定表达BCR-ABLT3151的32D细胞(32Dp210-T315I细胞)为主要研究对象,利用Western Blot检测LC3Ⅱ的表达、利用共聚焦免疫荧光显微镜观察自噬小体,分析阿西替尼、博纳替尼是否能够诱导细胞自噬。检测HCQ能否抑制阿西替尼、博纳替尼诱导的细胞自噬,并比较阿西替尼、博纳替尼联合/不联合HCQ处理后32Dp210-T315I细胞的凋亡(流式检测Annexin V/7AAD)、克隆形成(在半固态的甲基纤维素培养液中进行7天的克隆形成实验)、周期(细胞固定/破膜后经PI染色,并采用流式细胞仪检测)及细胞衰老(衰老相关β-半乳糖苷酶染色),分析HCQ是否能够增强阿西替尼、博纳替尼对32Dp210-T315I细胞的杀伤作用。为了进一步验证HCQ是否通过抑制自噬发挥作用,利用shRNA敲降自噬蛋白ATG7来抑制细胞自噬,阿西替尼、博纳替尼处理ATG7敲降和未敲降的32Dp210-T315I细胞后比较细胞的凋亡和周期,分析抑制自噬是否增强了阿西替尼、博纳替尼在T315I突变CML治疗中的作用。采用32Dp210-T315I细胞建立裸鼠皮下成瘤的模型,比较阿西替尼单药治疗和HCQ联合阿西替尼治疗对小鼠肿瘤的抑制作用。结果:阿西替尼、博纳替尼诱导32Dp210-T315I细胞自噬。HCQ抑制了阿西替尼、博纳替尼诱导的细胞自噬,并且增强了阿西替尼、博纳替尼诱导的32Dp210-T315I细胞凋亡,增强阿西替尼、博纳替尼对细胞克隆形成的抑制作用;但并不能增强阿西替尼、博纳替尼诱导的32Dp210-T315I细胞周期阻滞和细胞衰老。靶向ATG7的shRNA可以有效敲降ATG7蛋白的表达,并抑制了阿西替尼、博纳替尼诱导的32Dp210-T315I细胞自噬。与HCQ的作用相似,ATG7蛋白敲降增强了阿西替尼、博纳替尼诱导的细胞凋亡,对阿西替尼、博纳替尼诱导的细胞周期阻滞无影响。结论:HCQ通过抑制自噬增强了阿西替尼、博纳替尼对32Dp210-T315I细胞的杀伤作用。第二章羟氯喹促进NKG2D-ULBP4介导的Vy9Vδ2 T杀伤酪氨酸激酶抑制剂耐药的CML细胞背景:通过靶向自噬HCQ不仅可以提高多种药物的抗肿瘤作用,还可以有效促进肿瘤的免疫清除,抑制低氧诱导的自噬可以提高肺癌细胞对NK细胞杀伤作用的敏感性,抑制黑色素瘤细胞自噬也可以促进CTL杀伤黑色素瘤细胞,抑制自噬也可以增强IL2及某些肿瘤疫苗的治疗作用。免疫治疗已经成为白血病治疗的趋势,Vγ9Vδ2T细胞是一种具有很强肿瘤杀伤能力的免疫细胞,甚至可以有效杀伤TKIs耐药的CML细胞,是细胞免疫治疗的"明日之星"。本部分旨在研究HCQ是否能够促进Vy9Vδ2T细胞杀伤TKIs耐药的CML细胞,并揭示其作用机制。目的:探索自噬抑制剂—羟氯喹(HCQ)是否能够增强Vγ9Vδ2 T细胞对TKIs耐药CML细胞的杀伤,并进一步揭示其作用机制,为推动HCQ联合Vγ9Vδ2 T细胞免疫治疗在TKIs耐药CML治疗中的应用奠定基础。方法:以K562/GO1细胞(人CML伊马替尼耐药株)和K562细胞(人CML伊马替尼敏感株)为实验对象,通过Western Blot检测细胞内LC3Ⅱ、P62的表达、透射电子显微镜观察细胞内自噬小体的数量,分析HCQ对细胞的自噬抑制作用。以HCQ预处理的K562/GO1细胞和K562细胞为实验组靶细胞,PBS预处理的K562/GO1细胞和K562细胞为对照组靶细胞;以健康志愿者外周血来源的Vγ9Vδ2 T细胞为效应细胞。将CML细胞株与Vγ9Vδ2 T细胞以不同的效靶比共培养进行杀伤实验,比较实验组靶细胞和对照组靶细胞对Vγ9Vδ2T细胞敏感性的差别。靶细胞与效应细胞以1:1的效靶比共培养4h后,流式细胞仪检测Vγ9Vδ2T细胞的脱颗粒水平,分析不同靶细胞诱发Vγ9Vδ2 T细胞脱颗粒的差异,并利用CML患者来源的白血病细胞作为靶细胞再次验证脱颗粒实验的结果。采用shRNA敲降ATG7蛋白抑制细胞自噬,检测抑制自噬是否能够增强CML细胞对Vy9Vδ2 T细胞杀伤作用的敏感性,并检测HCQ是否能够增强ATG7敲降的CML细胞对Vγ9Vδ2 T细胞的敏感性,分析HCQ是否通过抑制自噬发挥增敏作用。流式细胞仪检测PBS或HCQ处理对CML细胞表面NKG2DL(MICA/B、ULBP1-6)表达的影响,并利用NKG2D阻断性抗体阻断Vγ9Vδ2 T细胞表面NKG2D与CML细胞表面NKG2DL的相互识别,分析诱导ULBP4(一种NKG2DL)在CML细胞膜表达是否为HCQ增强CML细胞对Vy9Vδ2 T细胞敏感性的机制。通过Western Blot、荧光定量PCR、流式细胞仪检测ULBP4的表达,共聚焦免疫荧光显微镜检测ULBP4在细胞内的分布揭示HCQ促进ULBP4表达的机制。结果:HCQ可以有效阻断K562/GO1细胞和K562细胞自噬,并且增强了K562/GO1和K562细胞对Vγ9Vδ2 T杀伤作用的敏感性。但敲降ATG7蛋白阻断细胞自噬并不能模拟HCQ的增敏作用,即使在ATG7敲降的K562/GO1和K562细胞中HCQ依旧可以提高Vγ9Vδ2 T对肿瘤细胞的杀伤作用,提示HCQ的增敏作用并不依赖于抑制肿瘤细胞自噬。HCQ诱导了 ULBP4在K562/GO1和K562细胞膜表达,阻断NKG2D与NKG2DL的相互识别后HCQ的增敏作用几乎消失,提示诱导ULBP4在CML细胞表面表达是HCQ促进Vy9Vδ2 T杀伤CML细胞的关键。进一步研究发现HCQ并没有提高ULBP4的转录及合成,而是诱导细胞内潴留的ULBP4转移到细胞膜。结论:HCQ诱导ULBP4从K562/GO1和K562细胞浆向细胞膜转移,促进了 Vy9V82 T细胞对K562/GO1和K562细胞的识别和杀伤。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R733.7

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本文编号：1262779