旋毛虫Nudix水解酶的克隆表达与功能鉴定

发布时间：2017-12-09 03:04

  本文关键词：旋毛虫Nudix水解酶的克隆表达与功能鉴定

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【摘要】：自1835年旋毛虫被发现以来尚无有效的预防疫苗。旋毛虫幼虫囊包经口感染宿主后,在胃液的作用下幼虫自囊包内逸出,在胆汁作用下发育为肠道感染性幼虫,然后侵入肠黏膜经4次蜕皮发育为成虫。因此,旋毛虫幼虫侵入肠黏膜继续发育是旋毛虫感染宿主的关键步骤,但旋毛虫侵入肠黏膜的机制尚不完全清楚。由于旋毛虫口孔无齿状及矛状结构,幼虫侵入肠上皮细胞(IECs)不是简单的机械性侵入,很可能与幼虫表面或者口孔分泌的一些蛋白有关,这些蛋白可能与IECs相互作用而促进了幼虫的侵入。我们课题组前期应用Western blot与液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)分析感染性幼虫与IECs共孵育后蛋白的变化,发现有64种旋毛虫蛋白进入了IECs内,其中部分蛋白具有水解酶(如Nudix水解酶)活性;随后,又从旋毛虫肠道感染性幼虫T7噬菌体展示文库与感染性幼虫消减c DNA文库筛选到4个表达上调且能与IECs结合的旋毛虫基因,其中1个为旋毛虫Nudix水解酶(Ts Nd)基因。Nudix超家族主要是由焦磷酸水解酶组成,催化的底物是一类与核苷二磷酸相连的残基X化合物(NDP-X);一些Nudix超家族成员具有降解潜在突变和降解氧化核苷酸的能力,而其他超家族成员可控制新陈代谢中间物和信号复合物的合成水平。我们课题组的研究发现,T7噬菌体展示的Ts Nd多肽可与小鼠IECs结合,免疫小鼠后可产生明显的免疫保护作用;应用RNAi干扰旋毛虫Ts Nd基因后,幼虫对IECs的侵入率明显下降;将Ts Nd DNA疫苗免疫小鼠后,可产生抗旋毛虫感染的部分免疫保护作用;提示Ts Nd可能在旋毛虫侵入IECs过程中具有重要作用,但关于Ts Nd的生物学特性、功能、与宿主的相互作用及其机制均不清楚。本课题克隆表达了Ts Nd,应用体内外实验对Ts Nd的生物学特性与功能进行了分析;应用ELISA的方法评价重组Ts Nd(r Ts Nd)对旋毛虫病血清学诊断的价值;使用右旋葡萄糖硫酸钠(DSS)肠炎模型观察了r Ts Nd对化学性诱导肠炎的免疫预防效果及其机制。本课题对于阐明Ts Nd与宿主IECs相互作用的机制具有重要的科学意义,并可为研制高保护性效果的旋毛虫病疫苗及旋毛虫蛋白抗炎新药等奠定基础。材料与方法1.实验小鼠、旋毛虫、质粒和菌株及细胞本研究使用的小鼠包括BALB/c小鼠、昆明小鼠及C57BL/6小鼠;旋毛虫包括旋毛虫(T1,ISS534),乡土旋毛虫(T2,ISS10)、布氏旋毛虫(T3,ISS100)、伪旋毛虫(T4,ISS13)及纳氏旋毛虫(T7,ISS29)。克隆和表达菌分别为大肠埃希菌JM109和BL21(DE3);克隆载体为p GEM-T,表达质粒为p MAL-c2X。小鼠小肠上皮细胞(IECs)为本课题组前期分离得到,小鼠成肌细胞(C2C12)、乳仓鼠肾细胞(BHK)、小鼠巨噬细胞Raw264.7及小鼠骨髓来源的巨噬细胞(WT macrophage)均由其他实验室惠赠。2.Ts Nd的生物信息学分析、克隆表达与鉴定应用ORF Finder、Ex PASy服务器、Prot Scale程序、TMHMM Server v.2.0、DNAstar Protean软件等生物信息分析软件对Ts Nd的生物学信息进行分析;然后对Ts Nd基因进行克隆、表达和纯化,用Western blot分析r Ts Nd的抗原性及免疫原性;将纯化的r Ts Nd免疫小鼠,制备抗r Ts Nd血清,分析其免疫应答类型及抗旋毛虫攻击感染的免疫保护作用。3.Ts Nd的生物学特性及功能分析用q PCR及间接免疫荧光实验(IFT)对Ts Nd的转录水平、表达时相及在虫体组织的定位进行分析;应用Ames和Dubin的方法及高效液相色谱(HPLC)对r Ts Nd的酶活性进行分析;应用旋毛虫体外侵入IECs模型,对旋毛虫侵入不同细胞的敏感性、r Ts Nd与抗r Ts Nd血清对旋毛虫幼虫侵入IECs的促进或抑制作用进行分析;应用Far Western、IFT及激光共聚焦显微镜对r Ts Nd与IECs的相互作用进行分析。通过抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)实验观察抗r Ts Nd抗体对旋毛虫幼虫的毒性作用。4.rTsNd用于旋毛虫病诊断应用肌幼虫排泄分泌(ES)抗原与r Ts Nd分别建立检测旋毛虫抗体Ig G的ES-ELISA与r Ts Nd-ELISA方法,检测不同旋毛虫、其他虫种及不同时间旋毛虫感染小鼠后血清抗体水平,分析r Ts Nd-ELISA诊断旋毛虫病的敏感性与特异性。观察r Ts Nd-ELISA对旋毛虫早期感染的诊断效果。5.r Ts Nd对DSS诱导结肠炎的免疫治疗效果及其机制将r Ts Nd腹腔免疫小鼠(以PBS腹腔注射为对照组),然后用2.5%DSS诱导2组小鼠化学性结肠炎,每天观察小鼠的身体状况并记录其体重,诱导后第10天将小鼠用CO2处死,收集小鼠血清、结肠,分离脾脏和肠系膜淋巴结细胞;根据小鼠体重及结肠炎症变化分析r Ts Nd免疫后对DSS诱导结肠炎的免疫预防效果;通过检测小鼠血清抗体(Ig G1、Ig G2a及Ig E)、脾脏和肠系膜淋巴结免疫细胞产生细胞因子的水平及r Ts Nd在体外对脂多糖(LPS)刺激巨噬细胞产生促炎因子的影响,分析r Ts Nd对DSS诱导结肠炎的可能作用机制。6.统计学处理使用SPSS17.0及Graphpad Prism软件对数据进行处理与分析。数据采用均数±标准差,r Ts Nd抗原检测旋毛虫抗体敏感性和特异性及旋毛虫感染后不同时期抗体水平使用卡方检验和重复测量方差分析,其他多组间的比较使用方差分析,两组之间的比较使用t检验,检验水准为α=0.05。结果1.Ts Nd的生物信息学分析、克隆表达与鉴定Ts Nd基因序列分析显示,Ts Nd基因开放阅读框架(ORF)为碱基全长的第111到1358位,总长1248bp,编码415个氨基酸,蛋白分子量大小为46 k Da,等电点为8.85,含有一个跨膜螺旋区,无信号肽,具有良好的抗原性,有两个保守区,分别是Nudix模体和Yhf T,Nudix模体为Nudix水解酶的活性位点和金属结合位点。利用克隆表达技术,成功构建了p MAL-c2X-Ts Nd重组表达质粒,测序结果表明本研究克隆的Ts Nd与Genbank中Ts Nd的序列一致性为99.3%;序列比对及系统进化分析显示Ts Nd与伪旋毛虫Nudix水解酶的相似性最高、系统发生关系最近。重组质粒能在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达出可溶性的r Ts Nd。SDS-PAGE结果表明r Ts Nd的分子量为89k Da(46 k Da+43 k Da MBP tag),与预测的r Ts Nd的分子量一致。Western blot分析发现r Ts Nd可被旋毛虫感染小鼠血清、r Ts Nd免疫小鼠血清所识别;r Ts Nd免疫小鼠血清可识别旋毛虫肠道感染性幼虫、肌幼虫、成虫和新生幼虫粗抗原及肌幼虫ES抗原中的天然Ts Nd蛋白。将r Ts Nd免疫小鼠3次后ELISA检测小鼠抗r Ts Nd抗体滴度为1:106,血清抗r Ts Nd Ig G1明显高于Ig G2a,表明r Ts Nd免疫小鼠后产生了Th2型为主的免疫应答。对免疫小鼠用300条旋毛虫幼虫攻击感染后3d与35d,肠道成虫和肌幼虫减虫率分别为57.70%和56.9%,表明r Ts Nd免疫小鼠后对旋毛虫感染可产生部分免疫保护作用。2.Ts Nd的生物学特性与功能通过PCR和IFT分析发现Ts Nd基因在旋毛虫不同发育期(肌幼虫、肠道感染性幼虫、成虫、胚胎、新生幼虫)均有转录和表达,并且在感染性幼虫的转录和表达水平较高;肌幼虫虫体石蜡切片IFT显示,Ts Nd主要定位于虫体的表皮、生殖原基及生殖器官部位。酶活性实验结果显示r Ts Nd具有天然的Nudix水解酶活性,能对d GTP,NAD,NADP和Co A产生水解作用,并对d GTP的水解作用最强。经HPLC分析,r Ts Nd对d GTP水解作用的最适条件为37°C、p H 8.0及有Zn2+存在。旋毛虫对不同细胞侵入的敏感性研究显示,旋毛虫幼虫对IECs的侵入率最高(31.55%),C2C12与BHK细胞对旋毛虫幼虫的侵入不敏感,表明旋毛虫对细胞的侵入具有特异性与选择性。IFT结果表明,r Ts Nd能够与IECs及小肠上皮细胞特异性结合,但不能与C2C12细胞、BHK细胞及肺组织结合;激光共聚焦显微镜发现r Ts Nd可特异性的结合在IECs细胞膜上;Far Western分析显示r Ts Nd可与IECs的10个蛋白条带结合,提示r Ts Nd能够与IECs中的蛋白产生相互作用。体外侵入实验发现r Ts Nd对旋毛虫幼虫侵入IECs具有促进作用,抗r Ts Nd血清组幼虫对IECs的侵入率明显低于正常血清组(9.83%vs 33.96%;χ2=18.15,P0.01),且抗r Ts Nd血清对幼虫侵入IECs的抑制作用具有抗体剂量依赖性。ADCC实验结果显示,抗r Ts Nd血清与正常血清组肌幼虫死亡率分别为76.16%和22.75%,肠道感染性幼虫的死亡率分别为66.84%和9.92%,两组血清幼虫的死亡率差异均有统计学意义(P0.05),表明抗r Ts Nd抗体参与了ADCC过程,可能与r Ts Nd免疫小鼠后产生的免疫保护作用有关。3.r Ts Nd对旋毛虫病血清学诊断的潜在价值应用r Ts Nd-ELISA检测旋毛虫感染小鼠不同时间血清抗体,结果显示:r Ts Nd及旋毛虫肌幼虫ES抗原对旋毛虫感染小鼠血清的敏感性均为100%(30/30),特异性分别为100%(54/54)和98%(53/54),两种抗原特异性的差异无统计学意义(P0.05);r Ts Nd抗原与弓形虫、裂头蚴感染小鼠血清和正常小鼠血清无交叉反应。r Ts Nd对不同种旋毛虫感染小鼠的特异性的检测结果显示:r Ts Nd和ES抗原在检测T2、T3和T7感染小鼠血清抗体阳性率的差异无统计学意义(P0.05),而检测T4感染小鼠血清抗体的阳性率分别为63.64%和90.91%(P0.05),提示Ts Nd可能在成囊型旋毛虫(T1、T2、T3和T7)具有较高的表达并能被其抗血清识别,但在非成囊型旋毛虫(T4)的表达水平较低。r Ts Nd-ELISA和ES-ELISA对旋毛虫感染小鼠的早期血清检测结果表明,ES抗原最早检测出抗体阳性的时间为感染后10d,而r Ts Nd为感染后14d。4.r Ts Nd对DSS诱导结肠炎的免疫治疗效果及其机制PBS对照组小鼠在DSS处理后第4天出现肠炎迹象,第5天出现体重下降;而r Ts Nd免疫小鼠的肠炎体征不明显,其体重也得到较好的控制。诱导肠炎第10天,解剖小鼠发现PBS对照组小鼠的结肠明显变薄、变短,结肠切片HE染色发现结肠组织中出现了大量的炎症细胞浸润、溃疡、水肿、杯状细胞的丧失及正常肠结构的破坏,而r Ts Nd免疫组小鼠则未出现这种典型的炎症表现。结肠冰冻切片IFT结果显示,r Ts Nd免疫小鼠能够抑制结肠炎性组织中中性粒细胞/巨噬细胞的浸润。r Ts Nd免疫后小鼠血清Ig G1明显高于Ig G2a(P0.01),Ig E抗体浓度也明显升高,表明r Ts Nd免疫可诱导小鼠产生Th2型免疫应答。应用夹心ELISA对细胞因子的检测结果表明,r Ts Nd与巨噬细胞共孵育后可抑制巨噬细胞TNF-α的产生;r Ts Nd免疫接种能促进小鼠产生IL-4(P0.05),但可抑制IFN-γ与IL-17的产生;提示r Ts Nd对DSS诱导结肠炎的免疫预防效果可能与r Ts Nd抑制炎性细胞浸润及抑制Th1与Th17应答有关。结论1.本研究构建了p MAL-c2X-Ts Nd重组表达质粒,并成功克隆表达了r Ts Nd。发现Ts Nd在旋毛虫的各个发育时期中均有转录和表达,主要定位于虫体的表皮、生殖原基及生殖器官部位。2.r Ts Nd具有良好的抗原性、免疫原性及Nudix水解酶活性,能与宿主的肠上皮细胞特异性结合,r Ts Nd免疫小鼠对旋毛虫攻击感染具有部分免疫保护作用。3.r Ts Nd检测旋毛虫感染小鼠血清特异性抗体具有较好的敏感性和特异性。4.r Ts Nd免疫可诱导小鼠产生Th2型为主的免疫应答,r Ts Nd对DSS诱导的小鼠结肠炎具有免疫预防作用,可能与r Ts Nd抑制炎性细胞浸润及抑制Th1与Th17应答有关。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R382

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