肝细胞癌患者血清IGFBP7基因启动子甲基化状态及其临床意义研究

发布时间：2017-12-09 04:16

  本文关键词：肝细胞癌患者血清IGFBP7基因启动子甲基化状态及其临床意义研究

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【摘要】：第一部分血清IGFBP7基因甲基化在乙型肝炎病毒相关肝细胞癌诊断中的价值研究研究背景在中国,肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)最常见的致病原因为慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染。HCC发现时通常已处于晚期阶段,错过了最佳的治疗时机。即使在过去的几十年中随着肝癌诊断能力的增强、影像学检查手段的发展以及新的治疗策略的出现,肝癌患者的生存情况及预后仍然不容乐观,五年生存率仍然很低,预后很差。针对肝癌的这些疾病特点,早发现、早治疗对改善患者预后至关重要,是提高生存率的关键。肝组织病理学检查是诊断肝癌最可靠的方法,但其是一种侵入性的有创检查,操作复杂,风险较高,不适用于肝癌的早期筛查。到目前为止,肝癌的筛选和术后随访主要依赖于血清肿瘤标志物和腹部影像学诊断的联合应用。甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)为目前临床应用较多的血清标志物,具有无创性和可重复性等优势,但其灵敏性和特异性相对较低。超声等影像学检查手段易受到多种因素的影响,这使得在肿瘤初始阶段及时、有效的诊断肝癌较为困难。因此,完善HCC的早期诊断方法,寻找更为简易、灵敏的非侵入性生物标志物是临床医生亟待解决的问题。肝癌的发生、发展过程受到多种因素的影响,可能与遗传学、表观遗传学改变及环境因素的综合作用有关。作为一种广泛研究的表观遗传学修饰方式,DNA甲基化是调控基因表达的重要手段。到目前为止,越来越多的证据表明异常的DNA甲基化在肿瘤发展过程中发挥重要作用,特定基因的甲基化改变或可作为肿瘤早期诊断的潜在生物标志物。类似的甲基化改变也可在血清/血浆来源的循环游离DNA(cell-freeDNA,cfDNA)中检测到。cfDNA定义为血浆/血清中发现的细胞外DNA,其主要来自于原发肿瘤位点、循环肿瘤细胞及远处转移的凋亡和坏死的肿瘤细胞。作为一种非侵入性的"液体活检"检测手段,cfDNA甲基化检测可有效避免肿瘤组织活检,用于多种肿瘤的早期诊断。cfDNA的甲基化状态已成为HCC早期诊断最有前景的生物标志物之一。胰岛素样生长因子结合蛋白 7(insulin-like growth factor-binding protein 7,IGFBP7)在肿瘤中的作用备受关注。多个研究发现IGFBP7能抑制肿瘤细胞生长、促进肿瘤细胞凋亡、影响肿瘤血管稳定性,是一种典型的肿瘤生长抑制因子。IGFBP7异常甲基化已在多种肿瘤中得到证实,参与了肿瘤的发生、发展过程。近期研究显示,IGFBP7在HCC中也发挥抑癌基因的作用,因此我们推测血清IGFBP7基因启动子甲基化状态或可作为HCC患者早期诊断的潜在非侵入性生物标志物。目的本研究的主要目的是探讨HCC患者血清IGFBP7基因甲基化状态,研究血清IGFBP7基因甲基化在HCC诊断中的潜在价值。方法本研究共入组2011年6月～2012年7月期间在山东大学齐鲁医院就诊的136例HCC患者、46例慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者和35例正常对照者。HCC诊断标准参照2010年更新的美国肝病研究协会(American Association for the Study of Liver Diseases,AASLD)发布的《肝细胞癌临床指南》,所有入组的HCC患者均伴有慢性HBV感染。CHB诊断标准参考2009年更新的AASLD发布的《慢性乙型肝炎实践指南》:血清乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)阳性史超过6个月,现血清学检查证实HBsAg仍为阳性和(或)病毒学检查显示HBVDNA仍为阳性者。血清IGFBP7基因启动子甲基化状态采用甲基化特异性聚合酶链反应(methylation-specific polymerase chain reaction,MSP)测定。统计分析采用SPSS 16.0(Chicago,IL,USA)软件。两组数值变量之间的比较采用独立样本的t检验或Mann-Whitney U检验。应用卡方检验比较各个分组之间血清IGFBP7基因启动子甲基化状态的差异,并评估HCC患者血清IGFBP7基因启动子甲基化状态与临床病理指标之间的关系。我们应用多元logistic回归分析筛选血清IGFBP7基因启动子甲基化的独立影响因素。应用受试者工作特征曲线下面积(the area under the receiver operating characteristic curve,AUC)来评估血清IGFBP7基因启动子甲基化状态与血清AFP水平的诊断效能。采用灵敏性、特异性、阳性预测值、阴性预测值来评估不同指标的诊断准确性。P值0.05定为差异有统计学意义。结果1、136例HCC患者组中有89例(65%)发生IGFBP7基因启动子区异常甲基化,46例CHB患者组中有8例(17%)发生IGFBP7基因启动子区异常甲基化,35例正常对照者中有5例(14%)发生IGFBP7基因启动子区异常甲基化。HCC组IGFBP7基因启动子甲基化的比率明显高于CHB组(P0.001)和正常对照组(P0.001)。2、IGFBP7基因甲基化与患者的性别、年龄、HBeAg、吸烟史、饮酒史、肿瘤个数、肿瘤大小、组织学分级、TNM分期、CTP分级和血清AFP水平等之间无明显相关性(P0.05),而与血管侵袭具有明显的相关性(P = 0.010)。同时,我们应用多元logistic回归来筛选血清IGFBP7基因启动子甲基化的独立影响因素,结果显示各临床病理指标均不是IGFBP7基因甲基化的独立影响因素。3、我们评估了血清IGFBP7基因启动子甲基化状态对肝癌的诊断价值。当我们从CHB患者中诊断HCC时,血清IGFBP7基因启动子甲基化的诊断灵敏性和特异性分别为65%和83%;当我们从正常人中诊断HCC时,血清IGFBP7基因启动子甲基化的诊断灵敏性和特异性分别为65%和86%。在区分HCC与CHB患者时,血清IGFBP7基因启动子甲基化的AUC明显高于血清AFP水平(0.740 vs 0.618;P0.05)。4、我们比较了血清IGFBP7基因启动子甲基化状态联合AFP与单独应用AFP对HCC的诊断价值。当血清AFP水平低于20 ng/ml时,IGFBP7甲基化组的HCC诊断率明显高于IGFBP7非甲基化组(P0.001)。当血清AFP水平高于20 ng/ml时,IGFBP7甲基化组的HCC诊断率同样明显高于IGFBP7非甲基化组(P0.001)。在本研究中,共有143例患者可依据血清AFP水平高于20 ng/ml或IGFBP7基因启动子发生甲基化而考虑诊断为肝癌(阳性),其中有116例肝癌患者(真阳性)和27例CHB患者(假阳性)。共有39例患者可依据血清AFP水平低于20 ng/ml且IGFBP7基因启动子未发生甲基化而考虑排除肝癌(阴性),其中有19例CHB患者(真阴性)和20例肝癌患者(假阴性)。血清AFP水平单独诊断肝癌的灵敏性和特异性分别为57%和52%。联合血清IGFBP7基因启动子甲基化与AFP诊断肝癌的灵敏性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为85%、41%、81%和49%。本研究证实AFP和IGFBP7甲基化的联合应用比单独应用AFP具有更高的灵敏性(P0.001)和阴性预测值(P = 0.03),但在特异性(P= 0.296)和阳性预测值(P=0.525)方面没有明显差异。结论1、我们的研究结果首次证实HCC患者存在血清IGFBP7基因启动子区甲基化的异常,提示检测该指标可作为HCC诊断非侵入性的生物学标志物。2、血清IGFBP7基因甲基化在发生血管侵犯的HCC患者中更容易检测到,提示IGFBP7基因甲基化或可用于判断HCC的血管侵犯。第二部分血清IGFBP7基因甲基化与乙型肝炎病毒相关肝细胞癌术后不良预后的关系研究研究背景肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是最常见的肝脏恶性肿瘤,是慢性肝脏疾病的严重并发症。HCC发病率逐年上升,是世界范围内癌症相关死亡的第三大常见原因,每年有大约600,000患者死于HCC。HCC的发病机制主要包括几个方面:原癌基因的激活、氧化应激、肿瘤抑制功能减退等。目前氧化应激与肝癌发生、发展之间的关系已经引起了越来越多的关注。氧化应激是身体接受有害的内源性或外源性因素刺激而发生的反应,越来越多的证据表明,氧化应激在HCC的发生和发展过程中扮演重要的角色。氧化应激发生时,机体生成大量活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS),超越了抗氧化剂系统的消除能力,体内氧化与抗氧化作用失衡,从而促进基因突变和表观遗传学改变而导致肿瘤的发生。异常的DNA甲基化是人类肿瘤发病机制中的一个常见事件,也是发挥致瘤作用的重要的表观遗传学机制。与致瘤作用相关的代表性的DNA甲基化改变包括:导致某些抑癌基因失活的CpG岛启动子区域高甲基化,导致基因组不稳定性、细胞转化和肿瘤进展的全基因组的低甲基化。目前已知有三种活跃的DNA甲基转移酶(DNA methyltransferases,DNMTs)参与基因甲基化过程的催化:DNMT1、DNMT3a和DNMT3b。许多研究表明,与肿瘤相关的DNA甲基化改变或可作为肝癌早期诊断及预后判断的指标,并可用于评估对治疗的反应。恶性肿瘤可通过肿瘤细胞的凋亡和坏死释放大量的DNA进入血液中,称为肿瘤来源的循环游离DNA(cell-free DNA,cfDNA)。不同的遗传和表观遗传分析已经证实了 cfDNA的临床意义。鉴于其样本获取简易,创伤较小,成本低廉,cfDNA作为肿瘤诊断的非侵入性生物标志物获得了越来越多的关注。在肿瘤细胞中的研究发现的DNA突变和甲基化改变等分子机制同样也出现在cfDNA中。大量的研究表明,cfDNA的甲基化是一种用于HCC早期诊断、风险评估、治疗反应及预后判断的非常有前景的生物标志物。胰岛素样生长因子结合蛋白 7(insulin-like growth factor binding protein 7,IGFBP7)的功能包括调节细胞增殖和分化,诱导细胞凋亡和细胞衰老等。前期研究显示,IGFBP7在包括HCC在内的多种肿瘤中发挥潜在的抑癌基因的作用,其水平与患者预后密切相关。我们的研究显示,血清IGFBP7基因启动子区域甲基化可以作为肝细胞癌诊断的非侵入性生物标志物。然而,血清IGFBP7基因甲基化与HCC患者预后的关系尚无研究。目的本研究的主要目的是探讨氧化应激、DNMTs mRNA表达与IGFBP7基因甲基化之间的关系,并评估血清IGFBP7基因启动子甲基化状态在HCC术后预后判断中的价值。方法本研究入组2010年I月～2013年1月期间在山东大学齐鲁医院就诊并接受手术切除的155例HCC患者。HCC诊断标准参照2010年更新的美国肝病研究协会(American Association for the Study of Liver Diseases,AASLD)发布的《肝细胞癌临床指南》,所有入组的HCC患者均伴有乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染。我们应用甲基化特异性聚合酶链反应(methylation-specific polymerase chain reaction,MSP)方法检测HCC患者血清IGFBP7基因启动子甲基化状态,应用实时荧光定量多聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)检测DNMTs mRNA水平,应用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)测定氧化应激状态,包括血清丙二醛(malondialdehyde,MDA)、黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase,XOD)、还原型谷胱甘肽(reduced glutathione hormone,GSH)、谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione-S-transferases,GST)水平。统计学分析采用统计软件SPSS version 16.0(Chicago,IL,USA)完成。数值变量由均数±标准差表示。分类变量由数值(百分数)表示。采用独立样本t检验和Mann-whitney U检验比较不同甲基化状态的HCC患者间数值变量的差异。采用卡方检验比较两组间分类变量的差异。运用Kaplan-Meier法,Log-Rank检验进行单因素分析,研究HCC患者术后总体生存率和早期肿瘤复发的相关因素。运用Cox比例风险回归模型进行多因素分析,研究HCC患者术后总体生存率和早期肿瘤复发的独立危险因素。P值0.05定为差异有统计学意义。结果1、本研究共入组155例肝癌术后患者,其中105例(67.7%)患者血清可检测到IGFBP7基因启动子甲基化。我们发现IGFBP7基因甲基化与血管侵袭、总体生存率、早期肿瘤复发密切相关,而与性别、年龄、血清甲胎蛋白水平、肿瘤数量、肿瘤大小、有无肝硬化、分化程度及TNM分期等并无显著的相关性(P0.05)。2、我们比较了 IGFBP7甲基化组和IGFBP7非甲基化组之间各氧化损伤指标的差异。结果显示IGFBP7甲基化组的MDA水平(P0.001)和XOD水平(P=0.014)均明显高于IGFBP7非甲基化组,IGFBP7甲基化组的GSH水平明显低于IGFBP7非甲基化组(P=0.009),而两组之间的GST水平并无明显差异(P=0.878)。3、我们比较了 IGFBP7甲基化组和IGFBP7非甲基化组之间DNMTs表达水平的差异。结果显示IGFBP7甲基化组的DNMT1 mRNA水平(P = 0.001)和DNMT3amRNA水平(P = 0.002)均明显高于IGFBP7非甲基化组,而IGFBP7甲基化组与IGFBP7非甲基化组之间的DNMT3b mRNA水平(P=0.386)并无明显差异。4、将肝癌切除手术日期作为随访的起始时间,死亡或最终的随访结束日期2016年1月为随访终点。我们评估了肝癌术后患者血清IGFBP7基因启动子甲基化状态对患者预后的判断价值。Kaplan-Meier曲线分析显示,IGFBP7基因甲基化与HCC患者术后的总体生存率明显相关(P0.001),发生IGFBP7基因甲基化的HCC患者预后更差。5、我们应用单因素分析研究影响HCC患者术后总体生存率的相关因素,发现肿瘤大小、血管侵袭、TNM分期、早期肿瘤复发和IGFBP7基因甲基化均与HCC患者的术后总体生存率有关。将上述指标纳入多因素分析,结果显示TNM分期(P=0.000)、早期肿瘤复发(P=0.000)和IGFBP7基因甲基化(P = 0.000)是影响HCC患者术后总体生存率的独立危险因素。6、我们应用单因素分析研究影响HCC患者术后早期肿瘤复发的相关因素,结果表明肿瘤大小、血管侵袭、TNM分期和IGFBP7基因甲基化与HCC患者术后早期肿瘤复发相关。我们将上述指标纳入多因素分析,结果显示TNM分期(P= 0.015)和IGFBP7基因甲基化(P= 0.008)是影响HCC患者术后早期肿瘤复发的独立危险因素。结论1、我们的结果表明IGFBP7基因启动子甲基化与HCC患者氧化损伤水平及DNMTs表达水平明显相关,提示氧化应激或可通过影响DNMTs表达诱导IGFBP7基因甲基化。2、IGFBP7基因启动子甲基化与血管侵袭、总体生存率和早期肿瘤复发相关,提示检测血清IGFBP7基因甲基化可作为HCC患者术后预后判断的潜在非侵入性生物标志物。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.7

【参考文献】

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1 Akinobu Takaki;Kazuhide Yamamoto;;Control of oxidative stress in hepatocellular carcinoma: Helpful or harmful?[J];World Journal of Hepatology;2015年07期

2 Manuel Schlageter;Luigi Maria Terracciano;Salvatore D'Angelo;Paolo Sorrentino;;Histopathology of hepatocellular carcinoma[J];World Journal of Gastroenterology;2014年43期

3 ;Science Letters:IGFBP7 plays a potential tumor suppressor role against colorectal carcinogenesis with its expression associated with DNA hypomethylation of exon 1[J];Journal of Zhejiang University Science(Life Science);2006年11期

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本文编号：1269046