聚乙二醇化氨磷汀的制备及其体内外安全性和抗氧化特性的初步研究

发布时间：2017-12-09 08:29

  本文关键词：聚乙二醇化氨磷汀的制备及其体内外安全性和抗氧化特性的初步研究

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【摘要】：氨磷汀是一种广谱的正常组织细胞抗氧化保护剂,在患者接受化疗或放射性治疗时,它能够选择性保护正常组织器官不受氧化损伤,同时不影响肿瘤治疗的效果。化疗和放射性治疗在杀伤肿瘤细胞的同时会造成全身系统性的损伤,其损伤的主要原因之一就是由细胞毒性药物或射线所产生的大量ROS对各脏器造成的氧化应激伤害。氨磷汀的分子末端具有一个可水解的硫代磷酸根,该基团在碱性磷酸酶的最适p H条件下快速水解,释放出游离的巯基。游离的巯基能够与氧化自由基(ROS)发生氧化还原反应,从而减轻或消除后者对组织器官的氧化损伤。正常组织细胞表面碱性磷酸酶含量较高,且细胞间液偏碱性,因此氨磷汀在正常细胞内能够快速水解为活性代谢产物,继而保护正常组织免受氧化损伤。而在肿瘤组织部位,大部分的肿瘤细胞膜表面碱性磷酸酶含量较低,且肿瘤细胞因缺氧等代谢异常行为导致其间液p H呈偏酸性,不利于碱性磷酸酶发挥作用,因此,氨磷汀无法快速有效的在肿瘤部位水解而影响肿瘤治疗的效果。因氨磷汀与ROS的反应是不可逆的消耗性的,而产生的大量ROS需要极高血药浓度的氨磷汀进行中和;同时,由于氨磷汀的活性代谢产物极不稳定,且易被肾脏快速清除,因此,为得到理想的治疗效果,临床上的氨磷汀使用剂量常常达到人的最大耐受剂量,从而导致使用氨磷汀的患者常会遭受剂量依赖的毒副作用,如一过性低血压,恶心和呕吐等,也使得氨磷汀的使用存在极大的局限性。聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)是一种FDA批准的可降解生物材料,它可以与不同种类药物结合,改善药物的药代动力学、药效学和安全性指标。聚乙二醇修饰广泛应用于多种治疗试剂,如蛋白或多肽药物、小分子药物以及纳米化的药物输运系统。聚乙二醇修饰能够改善不同药物试剂的溶解性、免疫原性、酶解特性以及体内的生物分布、网状内皮吞噬作用和肾脏清除率等。因此,小分子药物与聚乙二醇分子连接后,其体内循环半衰期和生物利用度均可得到提升。目前,有关氨磷汀的聚乙二醇化修饰还没有任何报道。于是,我们选择带有功能性末端的聚乙二醇对氨磷汀不参加反应的氨基末端进行修饰。由于直链聚乙二醇分子只能于其一端或两端载带一个或两个氨磷汀分子,且聚乙二醇与氨磷汀之间的分子量存在较大差异,因此,为提高氨磷汀的载带率,我们选择了四臂的聚乙二醇进行研究。在此工作中,我们通过琥珀酰亚胺活性酯与氨基的高效反应,构建了共价连接的四臂聚乙二醇化氨磷汀,并对其结构、形貌以及水解活力进行了表征。并且进一步检测了聚乙二醇化氨磷汀的细胞摄取能力、细胞毒性、抗氧化能力以及其体内、外的药效学评价。具体的实验结果如下:四臂聚乙二醇连接氨磷汀的效率约为75%,即平均一分子的聚乙二醇末端共价连接了三分子的氨磷汀。氨磷汀与聚乙二醇连接后,由于分子缠绕及静电作用等因素,聚乙二醇化氨磷汀相互缠绕,形成团簇状球形纳米颗粒。这一形貌的变化预示着聚乙二醇化修饰改变了游离氨磷汀所具备的一系列理化特性。首先,氨磷汀能够在碱性磷酸酶催化作用下快速水解,生成含有自由巯基的活性代谢产物,而聚乙二醇修饰后的团簇状纳米颗粒结构改变了其在碱性磷酸酶催化下的反应速率,使氨磷汀的快速水解特性变为可控的缓慢释放过程。提示了其可能在体内具有长效稳定的抗氧化保护作用。在细胞摄取行为中,我们发现聚乙二醇化的氨磷汀与游离的氨磷汀小分子自由扩散进入胞内的方式不同,它可能是通过细胞内吞作用进入细胞内并定位于酸性溶酶体中的。在胞吞过程中,聚乙二醇化氨磷汀与细胞膜接触的时间延长,使其能够充分的与膜表面碱性磷酸酶接触,最大程度的释放有效的抗氧化巯基末端。在安全性评价研究中,游离氨磷汀具有较严重的细胞毒性,且这一细胞毒性可通过抑制碱性磷酸酶活性而得到缓解,说明其损伤因素主要为氨磷汀脱磷酸水解后所产生的活性代谢产物。而在同样的条件下,聚乙二醇化氨磷汀却对细胞生长几乎没有影响。氨磷汀活性代谢产物中的自由巯基在氧化损伤的过程中,是起到抗氧化保护作用的主要成分。而对于ROS水平较低的组织细胞,大量的小分子自由巯基易于发生自由扩散,并与细胞组织中生物大分子结合,破坏其生物结构,因而产生较严重的细胞毒性。而聚乙二醇化修饰给固定化的氨磷汀巯基末端提供了空间位阻并限制了它的自由运动,减少并阻碍了其末端自由巯基与生物大分子的接触,从而降低了氨磷汀的细胞毒性。在评价抗氧化能力的研究中,我们通过双氧水刺激细胞产生大量ROS进而构建了氧化损伤模型。聚乙二醇化氨磷汀在与细胞共孵育的24h内,均可保护其不受ROS的伤害,展示出稳定高效的抗氧化能力。相反,氨磷汀对细胞的保护时间更短,且长时间孵育还会刺激细胞产生更高水平的ROS。二者对化疗药物损伤的细胞的保护作用具有类似的结果。我们发现,聚乙二醇化氨磷汀同样能够选择性保护细胞膜表面高表达碱性磷酸酶的细胞,使其免受化疗药物顺铂的损伤,而对细胞膜表面低表达碱性磷酸酶的细胞几乎无保护作用。聚乙二醇化氨磷汀展现了极优的体外安全性及药效学特性,于是我们进一步验证了其体内的生物学活性。聚乙二醇化修饰增加了氨磷汀的分子量,因此,在体内应用之前,我们首先确定了它的体内安全剂量,这一安全剂量中所包含的有效氨磷汀的量仅约为游离氨磷汀体内使用剂量的十分之一。我们利用荧光素模拟氨磷汀,检测了聚乙二醇化氨磷汀的体内分布,发现其在肾脏中含量最多且滞留时间较长。在给予化疗药物顺铂的小鼠体内,注射聚乙二醇化氨磷汀能够完全逆转由顺铂引起的肾脏脂质过氧化损伤。而游离的氨磷汀非但没有产生保护活性,还加重了肾脏的损伤程度。随后,我们评价了氨磷汀与聚乙二醇化氨磷汀在小鼠受到放射性损伤后,对动物骨髓中淋巴细胞的保护效果。无论是游离的还是经过修饰的氨磷汀,其对骨髓淋巴细胞都有一定程度的保护作用,但是并未完全消除掉辐射所引起的细胞损伤。综上,我们的工作第一次以聚乙二醇为骨架对氨磷汀进行修饰,并发现聚乙二醇化氨磷汀相比游离的氨磷汀具有更优的体内、外安全性及生物活性,这些优势使得聚乙二醇化氨磷汀在临床转化应用过程中具有极大的发展前景。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R943

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