长春西汀对异丙肾上腺素诱导的SD大鼠心肌肥大的作用机制研究

发布时间：2017-12-09 09:07

  本文关键词：长春西汀对异丙肾上腺素诱导的SD大鼠心肌肥大的作用机制研究

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【摘要】：心肌肥大多是高血压性心脏病在病理学上表现,是导致心血管疾病发病率和死亡率增加的一个独立的危险因素,但其发展演变的具体机制尚不完全明确。心肌肥大是为了提供正常心搏出量的一种代偿性反应,预防和逆转心肌肥大可以显著改善患者的预后,因此,进一步研究心肌肥大发生的机制是非常必要的。MAPK和PI3K-AKt介导的信号通路是心肌肥大形成过程中的重要信号通路。研究他们的表达将有助于揭示心肌肥大及其逆转作用的机制。细胞内钠离子浓度在心肌肥大和心力衰竭中起关键作用。在心肌肥大和心力衰竭模型中Na+流入的增加或Na+内流转运蛋白的上调,导致细胞内钠离子浓度增加。钠通道蛋白5型α亚基(SCN5A)、Na+/K+-ATP酶(NKA)三种亚型和Na+/H+交换蛋白1(NHE1),都是关键的细胞内钠通道和转运蛋白。长春西汀具有电压依赖性钠通道抑制作用。长春西汀抑制大鼠的心肌细胞钠电流,其抑制心肌细胞钠电流的作用为剂量依赖性和电压依赖性且可逆,对钠通道的稳态激活和失活过程的影响,可使缓慢失活的钠电流减少。其对心肌细胞钠通道的抑制作用与河豚毒素(TTX)具有明显相似性。有研究表明,河豚毒素能够抑制心肌肥大。长春西汀是否也具有抑制心肌肥大的作用,有待进一步研究。长春西汀关于长春西汀对心血管系统的影响和治疗作用研究较少,还没有涉及心肌肥大的研究。体外和体内研究表明,应用异丙肾上腺素(ISO)是常用的建立心肌肥大模型的方法。我们将以异丙肾上腺素诱导形成心肌细胞和整体动物心肌肥大模型为研究对象,运用分子生物学、生物化学、形态学等技术,研究长春西汀是否能通过抑制MAPK和PI3K/Akt信号通路的激活抑制异丙肾上腺素诱导的心肌肥大的发生发展,以及对细胞内关键的钠通道和转运蛋白的表达和细胞内钠离子浓度的影响,观察其对整体动物心肌肥大模型的作用。第一部分长春西汀对体外培养ISO诱导SD大鼠肥大心肌细胞的影响目的:观察长春西汀对体外培养异丙肾上腺素(ISO)诱导的肥大心肌细胞的影响,探讨磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)和MAPKs信号通路的调控作用;检测心肌细胞内钠离子浓度和关键钠通道及转运蛋白的表达,探讨其在心肌肥大调控中作用。方法:体外培养原代心肌细胞,mtt法测定长春西汀对心肌细胞活性的影响,确定安全药物浓度,心肌细胞经过72小时培养,dmem培养基(不含血清、酚红)处理,分成6个组:(1)对照组(controlgroup):加等量的dmem;(2)iso组:异丙肾上腺素(10μmol/l);(3)vinp1组:iso+vinp(5μmol/l);(4)vinp2组:iso+vinp(10μmol/l);(5)vinp3组:iso+vinp(20μmol/l);(6)vinp4组:iso+vinp(40μmol/l)。应用药物处理48小时后,测定细胞表面积,心肌细胞蛋白含量等细胞表型变化,应用药物处理6小时后,反转录-聚合酶链反应(rt-pcr)检测心肌细胞的anp、bnp、pi3k、aktmrna水平,应用蛋白印迹法检测总的akt和磷酸化akt、总的erk和磷酸化erk、总的jnk和磷酸化jnk、总的p38和磷酸化p38表达相对含量;检测钠通道蛋白5型α亚基(scn5a)、na+/k+-atp酶(nka)三种亚型(nka-α1、nka-α2、nka-α3)、na+/h+交换蛋白1(nhe1)的表达。使用共聚焦成像检测载有钠敏感性荧光染料corona绿的心肌细胞中钠离子浓度。结果:(1)长春西汀浓度依赖性的降低肥大心肌细胞的心肌细胞表面积和总蛋白含量,抑制肥大心肌细胞anp、bnpmrna的表达,改善pi3k、aktmrna表达,增加磷酸化akt蛋白表达,减少磷酸化erk、p38蛋白表达。(2)长春西汀抑制了iso诱导的肥大心肌细胞内钠离子浓度的增加;iso组和长春西汀组的心肌细胞中scn5a的蛋白表达没有显著变化(p0.05),但是在心肌细胞中,iso使nka-α2和nka-α3的蛋白表达显著降低(两者均为p0.05),但是nka-α1不受影响(p0.05,iso相对于对照组)。长春西汀明显减弱了iso对nka-α2和nka-α3蛋白表达的抑制(p0.05,长春西汀组相对于iso组)。与nka-α2和nka-α3的蛋白表达的减少相反,iso使得nhe-1蛋白表达显著增加,而且增加不受长春西汀的影响。结论:长春西汀对iso诱导的心肌肥大具有抑制作用。其可能机制为:通过影响pi3k-akt和mapk信号通路和钠通道的阻断作用。第二部分长春西汀对iso诱导心肌肥大sd大鼠心肌重构的影响目的:研究长春西汀对iso诱导心肌肥大sd大鼠心肌重构的影响。方法:将55只成年雄性sd大鼠随机分成4组:对照组10只、通过iso诱导建立的大鼠心肌肥大模型组45只。将心肌肥大模型组大鼠随机分为3组:单纯心肌肥大模型组(iso组)15只,治疗组又分为:单纯心肌肥大+长春西汀10mg(vinpi组)15只,单纯心肌肥大+长春西汀20mg(vinpii组)15只。所有大鼠相同饲养条件下饲养,成年雄性SD大鼠清醒状态下每日分两次(上午10点、晚上8点各1次)经背部皮下注射5 mg/kg/d异丙肾上腺素,共连续给药4周。对照组大鼠相同方式给予2ml生理盐水也分两次(上午10点、晚上8点各1次)经背部皮下注射。对照组大鼠和心肌肥大组同时给予每日2ml生理盐水灌胃治疗;Vinp I组和Vinp II组每日分两次(上午10点、晚上8点各1次)经背部皮下注射5mg/kg/d异丙肾上腺素同时,分别给予长春西汀10 mg/kg/d和20 mg/kg/d灌胃治疗;处理4周后观察的主要指标有:各组动物尾动脉血压(代替平均动脉压作为衡量心脏后负荷的指标)、左心室质量指数、心肌肥大细胞最短直径和横截面积、心肌间质胶原容积分数以及心肌羟脯氨酸含量等各项心肌肥大指标。结果:(1)长春西汀缓解ISO导致的大鼠尾动脉血压下降。长春西汀抑制了ISO诱导的单纯心肌肥大组左心室重量、左心室质量指数的升高(P0.05),差异具有显著性。(2)长春西汀治疗组与心肌肥大组大鼠相比,心肌细胞最短径和心肌细胞横断面面积下降(P0.05),有显著性差异。(3)长春西汀治疗组与心肌肥大组大鼠相比,心肌间质胶原容积分数和心肌羟脯氨酸含量均明显下降(P0.05),有显著性差异。结论:长春西汀具有改善ISO诱导的心肌肥大SD大鼠心肌重构的作用。
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R54

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