巨噬细胞β-arrestin-1及CB2受体在溃疡性结肠炎中的作用及机制研究

发布时间：2017-12-11 07:40

  本文关键词：巨噬细胞β-arrestin-1及CB2受体在溃疡性结肠炎中的作用及机制研究

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【摘要】：在全世界范围内,溃疡性结肠炎的发病呈现越来越高的趋势,在美国,每年用在治疗溃疡性结肠炎上的花费大概为81-149亿美元,而在欧洲,这个费用高达291亿欧元。在我国,随着经济的发展和人民生活水平的提高,溃疡性结肠炎患者的人数也逐年增多,另外由于溃疡性结肠炎的发病机制并不确切,目前所有的药物只能控制症状而不能彻底治愈,给全社会和患者带来了沉重的经济和心理负担。更值得关注的是,迁延不愈的结肠炎到最后很有可能发展为结肠癌,所以深入挖掘溃疡性结肠炎发生发展的病理生理机制,以及寻找新的药物治疗靶点对于溃疡性结肠炎的防治具有至关重要的意义。为了解决这一问题,本课题分为以下两个部分进行。第一部分为巨噬细胞β-arrestin-1在溃疡性结肠炎中的表达调控及作用研究。文献报道,全身敲除β-arrestin-1可以保护DSS和TNBS诱导的小鼠结肠炎,而非造血细胞系β-arrestin-1敲除则加重DSS诱导的小鼠结肠炎,说明不同细胞来源的β-arrestin-1对结肠炎的作用是不同的。为了明确造血细胞系的β-arrestin-1对肠炎的作用,本课题组利用Cre-LoxP重组酶系统培育了髓系(巨噬细胞)β-arrestin-1特异性敲除小鼠(β-arrestin-1floxp/floxpLysM-Cre),通过与野生型小鼠比较,发现β-arrestin-1floxp/floxp LysM-Cre小鼠对DSS诱导的结肠炎耐受性增加,表现为体重下降程度减轻,血便和结肠组织HE评分降低,说明髓系β-arrestin-1可以促进结肠炎的发病。接着我们提取了野生型和β-arrestin-1floxp/floxpLysM-Cre小鼠的腹腔巨噬细胞,给予TNF-α刺激,发现β-arrestin-1敲除后,TNF-α诱导的炎症因子水平降低。进一步我们通过Western blot,免疫荧光和EMSA对β-arrestin-1促进巨噬细胞炎症因子表达的机制进行了探索,结果发现,β-arrestin-1可以促进TNF-α引起的巨噬细胞NF-κB和MAPK通路的活化,此外,免疫共沉淀表明,β-arrestin-1可以直接与NF-κB通路上的IKK和IκBα结合。另外,在DSS诱导的小鼠结肠炎模型中,我们发现β-arrestin-1的水平增加,同时在RAW264.7和体外培养的腹腔巨噬细胞中,TNF-α刺激也可以导致β-arrestin-1表达增加。为了明确β-arrestin-1的表达调控机制,我们利用双荧光素酶报告基因技术,发现NF-κB可能介导了β-arrestin-1的基因转录,进一步利用NF-κB活化抑制剂BAY11-7082证实了NF-κB确实能够调控β-arrestin-1的表达。通过这一部分实验,我们发现,巨噬细胞β-arrestin-1可以通过促进细胞内NF-κB和MAPK通路的活化来增加炎症因子的表达,从而使结肠炎加重,同时在结肠炎发生时,巨噬细胞又可以通过NF-κB调控β-arrestin-1的表达,本项实验从细胞特异性角度出发的思路可能会为溃疡性结肠炎的治疗策略提供新的研究方向。第二部分为激活II型大麻素(Cannabinoid receptor 2,CB2)受体保护溃疡性结肠炎的机制研究。激活CB2受体可以产生抗炎作用,例如我们实验室已经发表的一篇文章揭示在类风湿性关节炎模型中,激动CB2受体可以减少滑膜细胞炎症因子的产生,并且抑制滑膜细胞的增生,降低关节中骨的破坏和白细胞的浸润,从而减轻关节炎的症状。自噬是细胞内一种重要的保护机制,通过降解物质可以为细胞提供能量,杀灭病原体可以使细胞免受侵害,其在细胞增殖,分化和死亡过程中发挥着重要作用;自噬能够降低过度激活的炎症免疫反应,因此参与多种疾病如肿瘤、感染、神经退行性病变和炎症的调控。在前期的工作中,本课题组发现激活CB2受体可以增加小胶质细胞(BV2细胞)的自噬,抑制NLRP3炎性小体的活性从而减轻小鼠自身免疫性脑脊髓炎。在这部分实验中,我们发现给小鼠腹腔注射CB2受体激动剂HU 308可以明显改善DSS诱导的结肠炎症状,而CB2受体敲除小鼠对DSS的敏感性增加,结肠炎症状更严重。进一步研究发现,激活CB2受体,小鼠结肠组织和巨噬细胞内的NLRP3生成减少,前体Caspase-1转化为活性Caspase-1的水平也降低,同时前体IL-1β生成减少,而自噬相关蛋白Beclin-1,LC3-II/LC3-I水平增加,SQSTM1减少;与野生型相比,CB2受体敲除导致小鼠结肠和巨噬细胞表达更多的NLRP3和前体IL-1β,且前体Caspase-1转化为活性Caspase-1增多,而自噬水平降低。为了明确自噬在CB2受体抑制NLRP3炎性小体中发挥的作用,我们用自噬相关基因5(autophagy targeted gene,Atg5)的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)干扰掉RAW264.7的自噬过程,结果发现Atg5 siRNA部分取消了CB2受体激动剂HU 308对NLRP3炎性小体的抑制作用,同时小鼠体内给予自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)也削弱了HU 308对DSS诱导的结肠炎的保护作用和对NLRP3炎性小体的抑制效果。最后,我们检测了自噬相关的信号通路,发现AMPK-mTOR-P70S6K介导了CB2受体对NLRP3炎性小体的抑制作用。由此,本项实验得出激活CB2受体可以通过增加自噬来抑制NLRP3炎性小体的活性,从而发挥保护结肠炎作用的结论,有望成为溃疡性结肠炎治疗的新策略和新靶点。
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R574.62

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本文编号：1277647