血清反应因子在糖尿病肾病上皮间质转分化中的作用及相关机制

发布时间：2017-12-11 22:27

  本文关键词：血清反应因子在糖尿病肾病上皮间质转分化中的作用及相关机制

  更多相关文章： 血清反应因子 糖尿病肾病 上皮间质转分化 CCG-1423 Snail

【摘要】：研究背景与研究目的糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)在糖尿病患者中的患病率大约为20%～40%,是糖尿病的重要并发症和主要死亡原因。近年来随着糖尿病患者人数的快速增长,DN的发病率逐年上升,在一些国家或地区已经成为终末期肾病(ESRD)的首位原因。DN的发病机制极为复杂,其确切机制尚未明确,多种因素通过各自作用以及相互交叉作用共同导致DN的发生和发展。对DN发病机制更深一步的研究,将对发掘DN有效的预防和治疗方法产生深远而重要的意义。足细胞是肾小球滤过膜极其重要的组成部分,其电荷屏障作用是阻止蛋白质漏出的关键。DN时足细胞发生EMT,足突融合、消失,随后发生阴离子电荷减少、微绒毛形成、体积缩小,足细胞最终从肾小球基底膜(GBM)上分离剥脱至肾小囊中,发生足细胞分离。通常认为足细胞EMT是足细胞损伤的起始环节,可以导致足细胞运动性增强、蛋白尿和肾小球纤维化。在EMT的过程中,足细胞标志物synaptopodin、紧密连接蛋白-1(zonula occludens,ZO-1)、P-cadherin 和nephrin降低,间质细胞标志物胶原蛋白-1、纤连蛋白(fibronectin,FN)、成纤维细胞特异性蛋白-1(Fibroblast specific protein-1,FSP-1)以及 α-平滑肌激动蛋白(α smooth muscle actin,α-SMA)升高。尽管传统观点认为DN是继发性肾小球疾病,现在越来越多的证据表明肾功能损伤的程度与肾小管间质纤维化的程度更加相关,肾小管损伤在DN进展中作用不容忽视。在肾小管上皮细胞(Renal tubular epithelial cells,TECs)EMT的过程中,上皮细胞标志物E-cadherin和ZO-1降低,间质细胞标志物FN、collagen-1、α-SMA、FSP-1 升高。Snail、Zeb 和 helix loop helix(HLH)家族都是引发EMT的重要转录因子,它们能够抑制E-cadherin的表达并促进间质细胞标志物的表达。血清反应因子(serum response factor,SRF)是高度保守的顺式作用因子,属于MADS-box转录因子家族。与SRF结合的DNA位点为血清反应元件(Serum response element,SRE),存在于几乎所有物种的基因组中,控制着细胞骨架和收缩蛋白的表达。SRF促进中胚层细胞迁移,在胚胎体轴延长中发挥重要作用,表明SRF对胚胎发育至关重要。根据目的基因的不同,SRF可以通过两条途径被激活(见图1):Ras-细胞外信号调节激酶(extracellular regulated kinase,ERK)-三重复合物因子(ternary complex factors,TCFs);Rho-肌动蛋白-心肌蛋白相关转录因子(myocardin related transcription factors,MRTFs/MAL)。大量研究表明SRF在上皮肿瘤(如肝细胞癌、胃癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌等)的EMT和转移过程中发挥重要作用。在转基因小鼠,过表达的SRF可以导致肌细胞肥大、间质纤维化和肌纤维损伤。相反的,SRF冠状动脉平滑肌细胞敲除可以降低血管平滑肌细胞的迁移和增殖能力。此外,SRF促进转化生长因子-β(transforming growth factor β,TGF-β)介导的肺肌成纤维细胞分化,应用蛋白激酶A降低SRF的表达和活性可以抑制这一作用。近期王汉民等研究表明,SRF在大鼠单侧输尿管结扎模型中可导致肾小管上皮细胞EMT;SRF通过snail信号转导通路加重高糖透析液引起的腹膜间皮细胞EMT。根据以上背景,我们提出如下假说:在高血糖情况下,大鼠肾脏中SRF和磷酸化SRF(pSRF)表达升高,并且从细胞质向细胞核转位增加,通过Snail信号转导通路导致足细胞和肾小管上皮细胞EMT,加重肾脏纤维化和蛋白尿;小分子抑制剂CCG-1423可以直接抑制SRF和pSRF的表达,减轻足细胞和肾小管上皮细胞EMT,改善糖尿病大鼠的肾脏纤维化和蛋白尿。为了验证此假说,我们通过1型糖尿病大鼠模型和体外培养永生化足细胞、近端小管上皮细胞,分别探讨SRF在DN肾小球纤维化和肾小管间质纤维化中的作用及相关机制,从而发掘DN新的治疗靶点。研究方法为了明确SRF在DN肾小球纤维化中的作用及相关机制,体外实验采用小鼠永生化足细胞,CCG-1423(1 uM或2μM)预处理1h后,进行高糖刺激72h;为了探索SRF是否促进足细胞EMT,我们采用SRF上调质粒转染足细胞,并使用Transwell小室迁移分析评估足细胞的迁移能力。体内实验采用一次性腹腔注射STZ(60 mg/kg BW)构建糖尿病大鼠模型,STZ注射后每日腹腔注射CCG-1423(0.01或0.02 mg/kg BW),持续8周。实验结束前对大鼠称重并放入代谢笼收取24h尿,然后抽血、灌流、取肾,随后检测和计算各项指标。采用western blot、实时荧光定量PCR(QPCR)和半定量PCR方法检测小鼠足细胞和大鼠肾皮质SRF、pSRF、synaptopodin、ZO-1、collagen-1、α-SMA 和 FSP-1 等的表达;免疫荧光染色检测足细胞中SRF的表达量和定位;实验室方法检测大鼠血糖、血肌酐、血尿素氮和24h尿蛋白定量;免疫组织化学染色(免疫组化)方法检测大鼠肾小球中SRF、P-cadherin、FN等的表达;PAS染色和masson染色评估大鼠肾小球纤维化的程度。为了明确SRF在DN肾小管间质纤维化中的作用及相关机制,体外实验采用永生化人近端小管上皮细胞(HK-2细胞),CCG-1423(1μM or 2μM)预处理1h后,进行高糖刺激72h;为了探索SRF是否促进HK-2细胞EMT,我们采用SRF上调质粒转染HK-2细胞,并使用Transwell小室迁移分析评估HK-2细胞的迁移能力。体内实验采用一次性腹腔注射STZ(60 mg/kg BW)构建糖尿病大鼠模型,STZ注射后每日腹腔注射CCG-1423(0.01或0.02 mg/kg BW),持续8周。实验结束前对大鼠称重并放入代谢笼收取24h尿,然后抽血、灌流、取肾,随后检测和计算各项指标。采用western blot和QPCR方法检测大鼠肾髓质和HK-2细胞SRF、pSRF、E-cadherin、ZO-1、collagen-1、α-SMA 和 FSP-1 等的表达;免疫荧光染色检测HK-2细胞中SRF的表达量和定位;实验室方法检测大鼠血糖、血肌酐、血尿素氮和24h尿蛋白定量;免疫组化方法检测大鼠肾髓质中SRF、E-cadherin、FN等的表达;PAS染色评估大鼠肾小管间质纤维化的程度。研究结果1.SRF在DN足细胞EMT中的作用及相关机制1.1高糖刺激导致足细胞EMT和SRF表达升高与正常组和甘露醇对照组相比,高糖刺激72h后,足细胞中SRF和pSRF的蛋白表达和基因表达均明显升高,足细胞标志物(synaptopodin、ZO-1)表达明显下降,间质细胞标志物(collagen-1,FN,FSP-1和α-SMA)表达明显升高。免疫荧光染色显示,高糖不仅导致SRF表达升高,而且诱导SRF向足细胞核内转移。1.2在足细胞中过表达SRF,导致EMT和肾小球滤过膜损伤与转染空白质粒(pcDNA3.1)的足细胞相比,转染SRF上调质粒(pcDNA-SRF)的足细胞中 synaptopodin 表达下降,collagen-1、FN、FSP-1、α-SMA 和 Snail表达升高。在Transwell小室迁移分析中,pcDNA-SRF组迁移数量较pcDNA 3.1组明显增加。在白蛋白滤过实验中,pcDNA-SRF组白蛋白滤过量较pcDNA 3.1组明显升高。1.3 CCG-1423对高糖诱导的足细胞EMT的作用与高糖组相比,经CCG-1423预处理的足细胞SRF、pSRF和Snail的蛋白表达和基因表达均降低,synaptopodin表达升高,collagen-1、FN、FSP-1和α-SMA表达降低。免疫荧光染色显示,CCG-1423不仅可以降低SRF的表达,而且还能抑制SRF向足细胞核内转移,从而进一步抑制SRF的作用。1.4糖尿病大鼠肾皮质中SRF的变化随着糖尿病时间的延长,大鼠肾皮质中SRF的蛋白表达和基因表达均逐渐升高。免疫组化表明,随着糖尿病病程的延长,肾小球中SRF的表达较正常组逐渐升高。1.5 CCG-1423对糖尿病大鼠生化指标的影响与正常组相比,DM组血糖、血肌酐、血尿素氮、24h尿蛋白定量和肾重体重比升高,血清自蛋白降低,所有糖尿病大鼠造模成功。与DM组相比,CCG-1423治疗后的糖尿病大鼠血清白蛋白明显升高,但是血糖、血肌酐、血尿素氮和肾重体重比没有变化。1.6 CCG-1423对糖尿病大鼠肾小球纤维化和蛋白尿的影响与DM组相比,CCG-1423治疗后糖尿病大鼠24h尿蛋白定量降低约500%,肾皮质SRF、pSRF、collagen-1、FSP-1表达量明显降低,synaptopodin表达量明显升高。免疫组化显示,与DM组相比,DM+CCG-1423组肾小球α-SMA和FN的表达降低,P-cadherin表达升高。Masson染色和PAS染色均表明,CCG-1423可以使糖尿病大鼠的肾小球纤维化程度明显减轻,肾小球硬化指数降低约500%。2.SRF在DN肾小管上皮细胞EMT中的作用及相关机制2.1高糖刺激导致HK-2细胞EMT和SRF表达升高与正常组和甘露醇对照组相比,高糖刺激72h后,HK-2细胞中SRF和pSRF的蛋白表达和基因表达均明显升高,上皮细胞标志物(E-cadherin和ZO-1)表达明显下降,间质细胞标志物(collagen-1,FN,α-SMA和FSP-1)表达明显升高。免疫荧光染色显示,高糖不仅导致SRF表达升高,而且诱导SRF向HK-2细胞核内转移,从而发挥调节转录的作用。2.2在HK-2细胞中过表达SRF导致EMT与正常组和pcDNA 3.1组相比,转染SRF上调质粒(pcDNA-SRF)的HK-2细胞中 E-cadherin 表达下降,collagen-1、FN、α-SMA、FSP-1 和 Snail 表达升高。在Transwell小室迁移分析中,pcDNA-SRF组迁移细胞数量较正常组和pcDNA 3.1组明显增加。2.3 CCG-1423对高糖诱导的HK-2细胞EMT的作用与高糖组相比,经CCG-1423预处理的HK-2细胞SRF、pSRF和Snail的蛋白表达和基因表达均降低,E-cadherin表达升高,collagen-1、FN、α-SMA和FSP-1表达降低。免疫荧光染色显示,CCG-1423不仅可以降低SRF的表达,而且还能抑制SRF向HK-2细胞核内转移,从而进一步抑制SRF的作用。2.4糖尿病大鼠生化指标的变化与正常组相比,随着糖尿病时间的延长,大鼠血糖、血肌酐、血尿素氮、24h尿蛋白定量和肾重体重比均逐渐升高,血清白蛋白逐渐降低,实验组所有糖尿病大鼠造模成功。2.5糖尿病大鼠肾髓质中SRF的变化随着糖尿病时间的延长,大鼠肾髓质中SRF的蛋白表达和基因表达均逐渐升高。免疫组化表明,随着糖尿病病程的延长,肾小管中SRF的表达较正常组逐渐升高。2.6 CCG-1423对糖尿病大鼠肾小管间质纤维化和白蛋白尿的影响与DM组相比,CCG-1423治疗后糖尿病大鼠肾髓质SRF、pSRF、collagen-1、α-SMA、FSP-1和Snail表达量明显降低,E-cadherin表达量明显升高,24h尿白蛋白定量降低约36.4%。免疫组化显示,与DM组相比,DM+CCG-1423组肾小管FN、FSP-1和Snail表达降低,E-cadherin表达升高。PAS染色表明,CCG-1423可以使糖尿病大鼠的肾小管间质纤维化程度明显减轻。结论1.高血糖激活大鼠肾脏中SRF,使SRF和pSRF表达升高,并且从细胞质向细胞核转移增加,通过Snail信号转导通路导致足细胞和肾小管上皮细胞EMT,导致蛋白尿、肾小球纤维化和肾小管间质纤维化。2.使用CCG-1423抑制SRF,可以使足细胞和肾小管上皮细胞EMT减轻,丢失减少,保护肾小球和肾小管的功能。3.使用CCG-1423抑制SRF,可以减轻DN的肾小球纤维化和肾小管间质纤维化,降低蛋白尿,升高血清白蛋白,延缓DN的进展,有望成为DN的有效治疗方法。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R587.2;R692.9

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 ;糖尿病[J];国外科技资料目录.医药卫生;1998年10期

2 ;糖尿病[J];国外科技资料目录.医药卫生;1998年01期

3 仝小林;;糖尿病9问(上)[J];药物与人;2007年03期

4 王秋月,刘国良;生活习惯与糖尿病[J];医师进修杂志;2000年09期

5 陈广耀;抗糖尿病中药开发前景展望[J];中国新药杂志;2000年07期

6 太田康晴,庄祥云;糖尿病[J];日本医学介绍;2000年08期

7 ;糖尿病[J];国外科技资料目录.医药卫生;2000年06期

8 ;糖尿病[J];国外科技资料目录.医药卫生;2000年08期

9 ;糖尿病[J];国外科技资料目录.医药卫生;2000年11期

10 林兰;倪青;董彦敏;;糖尿病中西医结合研究的思路与方法[J];医学研究通讯;2001年09期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 吴东方;庄跃宏;陈秀芳;赵丽娜;杨晓东;唐茂林;;胰岛素依赖型糖尿病对大鼠随意皮瓣存活能力的影响[A];中国解剖学会2012年年会论文文摘汇编[C];2012年

2 崔瑾;韩姣姣;李凤翱;李凤翱;汤绍芳;刘萍;邱明才;张鹏;;1,25-二羟维生素D3对糖尿病大鼠肺脏病变的保护作用[A];中华医学会第十二次全国内分泌学学术会议论文汇编[C];2013年

3 郑滨珠;袁凤山;杨润桥;;自体干细胞激活疗法治疗糖尿病大鼠过程中血细胞及生化改变[A];中华医学会第十二次全国内分泌学学术会议论文汇编[C];2013年

4 刘铜华;吕仁和;高彦彬;;中医药防治糖尿病及并发症的作用途径[A];糖尿病（消渴病）中医诊治荟萃——全国第五次中医糖尿病学术大会论文集[C];1999年

5 石凤英;王尧;;灵芝对糖尿病大鼠肾脏形态学及微量白蛋白尿的作用[A];中国康复医学会第三次康复治疗学术大会论文汇编[C];2002年

6 陈名道;李荣英;邵莉;;糖尿病饮食治疗的若干进展[A];中国营养学会第九次全国营养学术会议论文摘要汇编[C];2004年

7 仝小林;李洪皎;;糖络并重治疗2型糖尿病[A];第九次全国中医糖尿病学术大会论文汇编[C];2006年

8 李筱荣;李艳;刘巨平;袁佳琴;;糖尿病大鼠血—视网膜屏障损伤的实验研究[A];中华医学会第十二届全国眼科学术大会论文汇编[C];2007年

9 杨毅;陈江华;王晶晶;秦岭;;雷帕霉素对糖尿病大鼠肾脏组织增殖和肥大的抑制作用[A];2007年浙沪两地肾脏病学术年会资料汇编[C];2007年

10 祁少海;刘坡;舒斌;谢举临;徐盈斌;黄勇;毛任翔;刘旭盛;;不同深度糖尿病大鼠烫伤模型的制备[A];第八届全国烧伤外科学年会论文汇编[C];2007年

中国重要报纸全文数据库 前10条

1 郭赛珊　梁晓春 潘明政;中西医结合治疗糖尿病慢性并发症可显著改善症状[N];中国中医药报;2007年

2 本报记者 王乐羊;中西医结合防治糖尿病大有可为[N];中国中医药报;2002年

3 北京协和医院 梁晓春;对中医治糖尿病并发症研究的思考[N];中国中医药报;2011年

4 刘燕玲;肥胖是糖尿病的源头[N];健康报;2006年

5 仝小林;糖尿病慢性并发症论治[N];中国中医药报;2003年

6 汪敏;糖尿病皮肤易损元凶找到[N];卫生与生活报;2003年

7 林兰;中西医结合治疗糖尿病的前景[N];中国中医药报;2007年

8 北京协和医院中医科主任 梁晓春;糖尿病周围神经病变的中西医治疗进展[N];中国医药报;2009年

9 本报记者 刘艳芳;糖尿病干预不能忽视抗氧化[N];中国食品报;2012年

10 谭小月;糖尿病与肾病关系研究的新进展[N];中国中医药报;2004年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 冯伟伟;苹果酸铬对2型糖尿病大鼠的降血糖活性、作用机制及安全性初探[D];江苏大学;2015年

2 刘宇;糖尿病来源的骨髓间充质干细胞治疗心肌梗死的相关研究[D];第四军医大学;2015年

3 李维辛;GLP-1受体激动剂治疗糖尿病的循证评价和对糖尿病大鼠胃动力影响的机制研究[D];兰州大学;2012年

4 田丽;糖尿病周围神经病运动纤维的早期评价[D];天津医科大学;2014年

5 柳忠豪;糖尿病对口腔种植体骨整合影响的作用机制研究[D];山东大学;2015年

6 李波;饱和富氢液对糖尿病神经病变的保护作用及机制研究[D];天津医科大学;2015年

7 米佳;Vaspin调控糖尿病炎症通路及苦酸通调法的干预机制研究[D];长春中医药大学;2015年

8 林宣佑;从SCAP/SREBP脂代谢信号转导途径探讨苦酸通调方调控2型糖尿病胰岛素抵抗的作用机制[D];长春中医药大学;2015年

9 齐月;木丹颗粒治疗痛性糖尿病周围神经病变的实验研究[D];辽宁中医药大学;2015年

10 王云;糖基化终末产物介导的平滑肌病变在糖尿病结肠动力障碍中的作用研究[D];南京医科大学;2013年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 田宝明;低血糖指数挂面的研制及其对糖尿病大鼠糖脂代谢影响的研究[D];西南大学;2015年

2 黄琼;姜黄素对糖尿病大鼠肺组织损伤的保护作用及其可能机制[D];湖北科技学院;2015年

3 褚淑蕾;PI3k-Akt信号通路在2型糖尿病大鼠易发心房颤动中的介导作用[D];福建医科大学;2015年

4 石鹰;二膦酸盐对糖尿病大鼠下颌骨骨折愈合影响的实验研究[D];河北联合大学;2014年

5 郑嫦;CNP对Ach引起的糖尿病大鼠胃平滑肌收缩增强的影响及IGF-1的干预效应[D];延边大学;2015年

6 李宁;益气养阴活血方对糖尿病大鼠大血管NF-κB表达的影响[D];河北医科大学;2015年

7 王婉秋;辛伐他汀对2型糖尿病动脉硬化大鼠血浆VEGF、TGF-β1及CTRP3水平的影响研究[D];石河子大学;2015年

8 宋倩;2型糖尿病患者血清TLR-4水平与骨密度及影响因素关系研究[D];河北医科大学;2015年

9 王丽霞;TLR4及相关炎症因子在糖尿病大鼠心脏、肝脏和肾脏中的表达[D];河北医科大学;2015年

10 孙雪培;极长链脂肪酸与2型糖尿病大鼠脑Aβ生成的关系研究[D];河北医科大学;2015年

，

本文编号：1280171