胶质母细胞瘤肿瘤微血管形成机制及其靶向诊疗的MRI实验研究

发布时间：2017-12-12 00:09

  本文关键词：胶质母细胞瘤肿瘤微血管形成机制及其靶向诊疗的MRI实验研究

  更多相关文章： 胶质母细胞瘤 微血管形成 转分化 肾小球样微血管 磁共振成像 示踪 靶向 内皮祖细胞 组织因子 原位

【摘要】：背景和目的胶质母细胞瘤(Glioblastoma,GBM)是脑内最常见的恶性肿瘤,治疗效果不佳,预后差。GBM血管极为丰富,抗血管生成治疗主要用于复发性GBM,也有研究用于首次确诊GBM的治疗,能够短期有效,使肿瘤停止生长或缩小,延长部分病人生存时间。但是,往往在数周或数月内肿瘤失去对药物的反应而继续生长,且恶性程度增大。此时肿瘤的血管特征主要为管腔增大、不规则、内含多层分隔和多管腔,符合肾小球样微血管的形态特征。最近研究发现GBM内一部分干细胞样胶质瘤细胞可转分化为血管内皮细胞,参与肿瘤血管壁的形成,此血管形成方式被认为是目前抗血管生成治疗失败的原因之一。另一方面,相对于经典出芽血管,结构功能高度异常的肾小球样微血管形成与GBM患者无进展和总生存期显示出更强的负相关,抗血管生成治疗失败、复发多见于以肾小球样微血管为特征的GBM。前期研究发现,组织因子(Tissue factor,TF)在肿瘤内表达分布区域与肾小球样微血管分布区域一致。因此,我们认为TF可能在GBM肾小球样微血管形成起重要作用。以上发现将为抗血管生成治疗抵抗的机制研究提供新思路。因此,寻找针对抗血管生成治疗的新方法和相应的影像学表现成为当今研究的重点。为验证上述假设,本实验将从GBM肿瘤微血管内皮构成和分子调控作用到特殊的肾小球样微血管结构的形成进行系列研究,从肿瘤血管形成的微观层面到宏观层面进一步揭示GBM肿瘤微血管形成机制。第一部分,以GBM临床标本、大鼠C6原位胶质瘤组织以及胶质瘤细胞为研究模型,明确GBM肿瘤血管内皮构成及其MRI示踪研究。第二部分,以56例GBM患者为研究对象,并以裸鼠U87原位胶质瘤组织及胶质瘤细胞为研究模型,探讨GBM肾小球样微血管形成机制及其与MRI相关性研究。第三部分,针对以上GBM肿瘤微血管形成机制,对其进行靶向标记与治疗,并用MRI评价。本研究将为GBM有效抗血管生成治疗靶点筛选、靶向治疗、病程演变监测、疗效评估提供实验依据。材料和方法本研究由细胞实验、动物实验、临床实验三部分组成。细胞实验以U87人源性胶质瘤细胞系、C6大鼠源性胶质瘤细胞系、人脐静脉内皮细胞系和培养的大鼠脾脏来源的EPCs为研究对象。动物实验采用裸鼠和SD大鼠原位脑胶质母细胞瘤模型。临床实验以原发GBM患者为研究对象。一、胶质母细胞瘤肿瘤血管内皮构成及其MRI示踪研究1.临床GBM肿瘤标本、C6胶质瘤原位模型肿瘤组织冰冻切片,CD34、CD31、v WF免疫荧光染色检测肿瘤内血管内皮细胞CD34、CD31、v WF与GFP共同表达情况。2.将携带GFP的表达慢病毒质粒转染入C6胶质瘤细胞,并检测转染率。3.体外低氧环境培养C6胶质瘤细胞,CD34、CD31、v WF免疫荧光染色检测肿瘤内血管内皮细胞CD34、CD31、v WF与GFP共同表达情况。4.用DAPT、sunitinib和常氧环境刺激肿瘤细胞,流式细胞术检测刺激对肿瘤细胞转分化率的影响,体外成血管检测刺激对肿瘤细胞转分化为内皮细胞功能影响。5.免疫蛋白印迹检测肿瘤细胞和肿瘤组织内HIF-1α、Notch 1、Flk1和p-Flk1蛋白表达情况。6.密度梯度离心法从SD大鼠脾脏组织中获取单个核细胞,每隔3天换一次培养基,根据在培养过程中细胞形态学、双吞实验、体外成血管实验鉴定贴壁细胞是否为EPCs。7.用USPIO标记EPCs,经尾静脉注射入荷瘤鼠体内,用MRI T2加权成像、T2 map、SWI观察EPCs在肿瘤内数量、分布和与血管的关系。8.普鲁士蓝染色观察标记的EPCs在瘤内的分布情况,流式细胞术评估归巢至胶质瘤中的外源性EPCs的含量。二、胶质母细胞瘤肾小球样微血管形成及其与MRI相关性研究1.纳入56例GBM患者,收集患者肿瘤组织石蜡切片,CD34、GFAP免疫组化染色检测GBM组织内部分肿瘤血管内皮细胞CD34、GFAP共同表达情况,以及肿瘤微血管密度、面积、管径情况。TF、VEGF、HB-EGF免疫组化染色检测GBM组织TF、VEGF、HB-EGF蛋白表达情况。2.用免疫蛋白印迹和免疫荧光染色检测TF在U87胶质瘤细胞的表达和分布。3.用RNA干扰敲减U87胶质瘤细胞内TF的表达并检测敲减效率。4.建立裸鼠原位GBM模型,免疫组化检测瘤内TF表达区域与GBM抗血管生成治疗抵抗后形成的血管分布区域的相关性。5.肿瘤细胞相关实验分四组:对照组、TF9-10H10(TF抑制剂)干预组、空病毒组、TF敲减组,MTT法检测TF对U87胶质瘤细胞增殖能力的影响,划痕实验和transwell检测TF对U87胶质瘤细胞迁移能力的影响,流式分析TF对U87胶质瘤细胞凋亡的影响。6.收集内皮细胞条件培养基(Conditioned medium,CM),包括U87-CM、EV-CM和TF sh RNA-CM三组。用条件培养基刺激内皮细胞,检测各组CM(TF含量不同)对内皮细胞增殖、侵袭、体外成血管以及PAR2、HB-EGF蛋白表达的影响。7.纳入的GBM患者术前行常规MRI、MRI灌注成像(包括DCE-MRI和VSI-MRI)检测。8.GBM患者MRI表现、DCE-MRI和VSI-MRI相关参数值和GBM组织内TF表达、微血管形成情况的相关性分析。三、胶质母细胞瘤肿瘤微血管靶向标记与治疗及MRI评价1.免疫荧光染色和透射电镜观察外源性EPCs是否整合至含有肿瘤细胞-内皮转分化的肿瘤血管。2.免疫蛋白印迹检测肿瘤细胞和肿瘤组织内HIF-1α、Notch 1、Flk1和p-Flk1蛋白表达情况。3.移植EPCs荷瘤鼠分两组:对照组、BBG干预组。MRI检测两组肿瘤大小、血供、标记的EPCs归巢至肿瘤的分布和数量,免疫荧光检测调控P2X7受体对EPCs整合至含肿瘤细胞-内皮转分化血管的影响。4.TF实验动物模型分四组:对照组、空病毒组、TF敲减组、贝伐单抗干预组,建立裸鼠原位GBM模型。5.采用Kaplan-Meier分析法对四组动物模型进行生存分析,并检测各组是否存在显著性差异。6.MRI常规扫描监测各组动物模型在不同时间点肿瘤体积和侵袭情况的变化;MRI灌注扫描监测肿瘤血流灌注情况的变化。7.HE染色观察各组动物模型肿瘤侵袭情况。CD34免疫组化染色检测各组GBM组织微血管密度、面积、管径情况。8.免疫组化染色和免疫蛋白印迹检测各组动物模型肿瘤组织内TF、VEGF、HB-EGF蛋白表达情况。结果一、胶质母细胞瘤肿瘤血管内皮构成及其MRI示踪研究1.GBM肿瘤微血管肿瘤细胞-内皮转分化及其调节通过胶质瘤组织免疫组化及免疫荧光染色,发现肿瘤组织内部分微血管内皮细胞不仅表达内皮细胞标记物,还表达肿瘤细胞标记物,此种内皮细胞来源于肿瘤细胞转分化。同时,体外实验发现胶质瘤细胞能转分化为内皮细胞,并具有内皮细胞的功能。通过肿瘤组织和肿瘤细胞的免疫蛋白印迹发现,转分化率高的肿瘤/转分化诱导的肿瘤细胞HIF-1α、Notch 1、Flk1和p-Flk1表达量明显高于转分化率低的肿瘤/对照组。用DAPT、sunitinib和常氧环境干预肿瘤细胞转分化为内皮细胞实验,发现肿瘤细胞转分化率明显降低。2.外源性EPCs归巢整合至肿瘤血管与MRI活体示踪通过MRI T2加权成像(T2WI)、T2 map示踪和定量标记USPIO的外源性EPCs归巢至肿瘤,早期分布于肿瘤边缘,后逐渐分布于整个肿瘤。磁敏感加权成像显示标记的EPCs归巢至肿瘤血管。普鲁士蓝染色、免疫荧光染色及流式细胞术分析证实了MRI的发现,外源性EPCs可归巢整合至肿瘤血管,参与肿瘤血管内皮构成。二、胶质母细胞瘤肾小球样微血管形成及其与MRI相关性研究1.GBM肾小球样微血管与肿瘤内TF表达的关系和临床意义通过对56例GBM患者肿瘤组织免疫组化染色发现GBM肿瘤组织内TF表达量与肿瘤恶性程度成明显正相关。TF表达区域与肾小球样微血管分布区域相似,VEGF表达区域与血管芽生的分布区域相似。进一步分析发现肿瘤内TF表达与肾小球样微血管面积呈明显正相关,而VEGF表达与血管芽生的微血管密度呈明显正相关。2.TF介导的GBM肾小球样微血管形成的分子特征通过肿瘤组织的免疫组化和免疫蛋白印迹发现抑制TF表达可降低PAR2和HB-EGF的表达。条件培养基刺激内皮细胞发现TF可通过独立于VEGF的PAR2/HB-EGF信号通路调节内皮细胞的增殖、迁移、成血管能力。另一方面,通过体内MRI、病理分析和体外细胞侵袭实验发现TF可通过调控肿瘤细胞的侵袭能力来调节肾小球样微血管的形成。3.MRI活体评估GBM患者肿瘤内TF表达及肾小球样微血管肿瘤内分布情况通过对GBM患者术前行MRI解剖和功能成像与患者肿瘤组织内TF表达和微血管含量关联分析,发现瘤内TF表达水平高的GBM,Ktrans map显示肿瘤区域的血管通透性高,VSI map显示肿瘤血管管径较大,高通透性、大管径血管符合肾小球样微血管的特征。进一步分析发现Ktrans热点值和VSI热点值与GBM肿瘤组织内TF表达含量成明显的正相关。因此,MRI灌注成像的Ktrans热点值和VSI热点值可作为评估GBM患者肿瘤内TF表达和肾小球样微血管含量及分布的影像学标记物。三、胶质母细胞瘤肿瘤微血管靶向标记与治疗及MRI评价1.胶质母细胞微血管肿瘤细胞转分化的靶向诊疗载体及其调控通过免疫荧光染色和透射电镜显示外源性EPCs归巢整合至含有肿瘤细胞-内皮转分化的血管。并且,肿瘤细胞转分化率和HIF-1α、Notch 1、Flk1和p-Flk1表达水平在EPCs移植组/EPCs条件培养基干预组与对照组无显著差异。因此,EPCs可作为靶向载体,携带药物靶向治疗肿瘤细胞-内皮转分化。通过MRI T2WI、T2 map发现BBG(P2X7受体抑制剂)可抑制EPCs归巢至肿瘤,普鲁士蓝染色及流式细胞术证实了MRI的发现。磁敏感加权成像、免疫荧光染色和透射电镜显示BBG降低归巢整合至含有肿瘤细胞-内皮转分化血管的EPCs数量。因此,通过P2X7受体调控外源性EPCs整合至含有肿瘤细胞-内皮转分化的血管,以提高靶向示踪及治疗的效率。2.靶向抑制组织因子治疗胶质母细胞瘤肾小球样微血管形成及其MRI评价通过MRI T2WI显示TF敲减组的肿瘤体积和肿瘤侵袭面积明显减低,DCE-MRI灌注成像显示TF敲减组的肿瘤Ktrans值明显降低,SWI成像显示TF敲减组的肿瘤内低信号明显减少,以肿瘤周边较为明显。同时,免疫组化分析发现TF敲减组的肿瘤内微血管密度、面积、管径较对照组均显著降低,减低瘤内肾小球样血管形成。贝伐单抗组的肿瘤内微血管密度较对照组均显著降低,但微血管面积未见明显变化,管径增大,减低经典的血管芽生的形成。因此,靶向抑制TF在GBM肿瘤内的表达可显著抑制肿瘤生长和肾小球样微血管形成,并延长荷瘤鼠的生存时间。结论1.本实验揭示GBM肿瘤微血管形成可能涉及的两种机制:1)GBM肿瘤细胞-内皮转分化参与肿瘤微血管内皮构成;2)TF通过调控独立于VEGF的PAR2/HB-EGF信号通路促进内皮细胞增殖以及增加肿瘤细胞的侵袭能力,从而促进肾小球样微血管形成。2.外源性USPIO标记的EPCs可作为GBM微血管肿瘤细胞-内皮转分化的MRI靶向诊疗载体,P2X7受体调控可提高其靶向示踪及治疗的效率。3.靶向抑制TF治疗GBM能有效抑制肾小球样微血管形成,延长荷瘤鼠生存时间,同时MRI能有效的评价靶向抑制TF的治疗效果。Ktrans热点值和VSI热点值可作为活体评估肿瘤内TF表达和肾小球样微血管含量及分布的MRI影像学标记。这将为GBM抗血管生成新型治疗靶点筛选、病程演变监测和疗效评估等提供实验依据。
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R739.41;R445.2

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 于锡欣,李孟军;肿瘤微血管研究方法进展[J];中国矫形外科杂志;2000年03期

2 李福山;;肿瘤生长、转移与肿瘤微血管[J];广东医学;1996年11期

3 沈俊杰,陈自谦,曹建民;动脉灌注化疗栓塞与肿瘤微血管变化的研究进展[J];医学研究生学报;2004年12期

4 陈勇;刘巍;;恶性肿瘤微血管研究进展[J];中华肿瘤防治杂志;2007年11期

5 崔专义;张国栓;王桂琦;谷敬峰;左东明;杨永强;;肝细胞癌生物行为学特性与肿瘤微血管特征的关系研究[J];临床肝胆病杂志;2007年04期

6 孟晓,管淑萍;肿瘤微血管研究进展[J];医学信息;1998年04期

7 李功杰,杨立,史晓林,李晓兵,郑晓玲,王悦华;原发性肝癌肿瘤微血管形态特征研究[J];解放军医学杂志;2004年07期

8 李功杰,杨立,史晓林,盛复庚,乔鹏岗;原发性肝癌肿瘤微血管形态特征与其生物学特性的关系[J];世界华人消化杂志;2005年13期

9 罗文娟,吴文涛,达兴碧,刘剑刚;肿瘤微血管研究及进展[J];四川省卫生管理干部学院学报;2001年01期

10 汪永跃,王大章,郑光勇,毛祖彝;~(32)P玻璃微球间质治疗联合加热对肿瘤微血管作用的实验研究[J];口腔医学纵横;1998年02期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 黄丙仓;耿道颖;纪毅敏;李郁新;朱莉;尹波;鲍奕仿;;胶质母细胞瘤磁共振成像的一个重要征象——“丝瓜瓤样坏死征”[A];中华医学会第16次全国放射学学术大会论文汇编[C];2009年

2 顾金海;李刚;苏雨行;申杰;李蓉晖;贺峭伟;邓林;;STAT3 Decoy ODN抑制胶质母细胞瘤增殖实验研究[A];中华医学会神经外科学分会第九次学术会议论文汇编[C];2010年

3 秦立森;梁径山;石琼;于如同;;胶质母细胞瘤中强化与坏死比例与信号传导相关性的研究[A];中华医学会神经外科学分会第九次学术会议论文汇编[C];2010年

4 熊剑;章翔;程光;林洪;费舟;;Ardipusilloside Ⅰ诱导胶质母细胞瘤细胞凋亡的研究[A];中国医师协会神经外科医师分会第六届全国代表大会论文汇编[C];2011年

5 张成龙;李康印;郝晓东;陈虎义;高崎炜;强海霞;;儿童多发胶质母细胞瘤一例[A];2005年全国医学影像技术学术会议西部论坛论文汇编[C];2005年

6 颜伟;张伟;游赣;王永志;刘彦伟;杨沛;江涛;;甲基鸟嘌呤甲基转移酶蛋白表达和促进甲基化在中国胶质母细胞瘤患者中的临床关系[A];2011中华医学会神经外科学学术会议论文汇编[C];2011年

7 江涛;陈宝师;袁芳;李桂林;李少武;邱晓光;王忠诚;;胶质母细胞瘤临床治疗经验[A];中国医师协会神经外科医师分会第二届全国代表大会论文汇编[C];2007年

8 郑秀珏;黄欣;李谷;曹飞;龚江标;;胶质母细胞瘤术后同步放化疗的临床分析[A];2009年浙江省神经外科学术年会论文汇编[C];2009年

9 路翠平;;四十例胶质母细胞瘤术后护理体会[A];2011中华医学会神经外科学学术会议论文汇编[C];2011年

10 贺虎;李明武;牛朝诗;;胶质母细胞瘤干细胞能够分化为内皮细胞以促进肿瘤血管生成[A];2011中华医学会神经外科学学术会议论文汇编[C];2011年

中国重要报纸全文数据库 前10条

1 匡远深;治疗首次术后脑胶质母细胞瘤 放化疗同步优于单纯放疗[N];中国医药报;2008年

2 吴剑鹏;南方医院牵手多家医院联合开展胶质母细胞瘤研究[N];科技日报;2014年

3 炜闻;Avastin获准用于治疗胶质母细胞瘤[N];医药经济报;2009年

4 谷文;FDA批准Avastin 用于治疗胶质母细胞瘤[N];中国医药报;2009年

5 王小龙;一种化合物可引发癌细胞“自爆”[N];科技日报;2014年

6 ;腰椎间盘髓核退变的MRI表现与病理学的相关性研究[N];中国医药报;2003年

7 孙行之邋(编译);抵御肿瘤,疫苗将成为利器[N];第一财经日报;2008年

8 Tracy Staton 编译 石军;罗氏公开数据证“有效”[N];医药经济报;2014年

9 姜恒;我国医用永磁MRI磁体开发获重大突破[N];中国医药报;2006年

10 王迪;MRI“揪”出更多乳腺癌病例[N];医药经济报;2004年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 陈晓;胶质母细胞瘤肿瘤微血管形成机制及其靶向诊疗的MRI实验研究[D];第三军医大学;2017年

2 岳琪;调节性T细胞在胶质母细胞瘤中的预后作用及分化机制研究[D];复旦大学;2014年

3 陈鑫;CKS2在胶质母细胞瘤中的表达及其对肿瘤生物学行为的影响和机制研究[D];山东大学;2015年

4 吕磊;阿西替尼对胶质母细胞瘤及其肿瘤干细胞治疗作用的研究[D];复旦大学;2013年

5 周济;NTS/NTR1信号对人胶质母细胞瘤干细胞自我更新及侵袭能力的影响及机制[D];第三军医大学;2015年

6 李红伟;KAP调节ROCK2和Cdk2在RNA激活的胶质母细胞瘤侵袭途径[D];郑州大学;2014年

7 刘永良;沉默STAT5b的表达对人胶质母细胞瘤U251细胞增殖抑制及其机制研究[D];山东大学;2015年

8 纪祥军;Nrf2在人胶质母细胞瘤血管生成中的作用研究[D];南京大学;2013年

9 阮健;MicroRNA-181c对胶质母细胞瘤的抑制作用及其机制研究[D];重庆医科大学;2015年

10 姚轶群;RPS15A通过AKT调控细胞周期促进胶质母细胞瘤细胞增殖、迁移的体内和体外研究[D];大连医科大学;2015年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 李功杰;原发性肝癌肿瘤微血管形态特征与其生物学特性关系的研究[D];中国人民解放军军医进修学院;2002年

2 邱献新;Notch通路血管配体DLL4和Jagged1与原发性胶质母细胞瘤瘤周水肿及预后的关系[D];福建医科大学;2015年

3 林国诗;pSTAT3-VEGF信号通路与新诊断幕上胶质母细胞瘤瘤周水肿及预后的关系[D];福建医科大学;2015年

4 韩晓;miR-584对人胶质母细胞瘤侵袭和迁移能力的影响[D];山东大学;2015年

5 张X;贝伐单抗联合替莫唑胺同步放疗治疗新诊断胶质母细胞瘤有效性安全性的系统评价[D];广西医科大学;2015年

6 陈加贝;GBM个体化手术切除及分子标记物与磁共振影像的相关性研究[D];南方医科大学;2015年

7 欧阳佳;毛蕊异黄酮通过调控TGF-β介导的间质化改变抑制胶质母细胞瘤迁徙和侵袭[D];南昌大学医学院;2015年

8 王兵;Mda-9/Syntenin在胶质母细胞瘤细胞增殖、侵袭和迁移过程中的作用及分子机制[D];重庆医科大学;2015年

9 顾佳瑶;白藜芦醇对大鼠胶质母细胞瘤的抑制作用及其与STAT3信号通路的关系[D];大连医科大学;2015年

10 刘婷婷;AQP4在胶质母细胞瘤发展中的作用[D];安徽大学;2016年

，

本文编号：1280419