Ⅰ.低温条件下血小板氧化损伤机制的研究 Ⅱ.血小板冰冻保护剂DMSO的毒副作用初探

发布时间：2017-12-12 02:22

  本文关键词：Ⅰ.低温条件下血小板氧化损伤机制的研究 Ⅱ.血小板冰冻保护剂DMSO的毒副作用初探

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【摘要】：血小板(platelets,PLTs)作为人体血液中的重要组分,主要功能是促进止血和凝血,维护血管壁的完整性。血小板输注是临床治疗血小板减少相关疾病的有效措施,提供足量安全的血小板制品对临床及战伤救治意义重大。然而,目前临床血小板供应存在供、求矛盾,一方面是血小板保存时间短,美国食品药品管理局(food and drug administration,FDA)规定保存期仅为5天(22℃±2℃),易过期浪费;另一方面,战时、突发事件情况下血小板的需求量增大,供不应求。因此研究血小板长期保存成为输血医学的热点问题。目前,延长血小板保存期的方法主要有:4℃冷藏保存、冰冻干燥保存和-80℃冰冻保存,但均存在血小板的低温损伤。血小板低温损伤机制尚不明确,Mazur提出-80℃冰冻保存损伤主要有两大原因:“冰晶假说”和“盐害假说”。冰晶假说是指低温保存过程中,细胞内形成冰晶,造成血小板不可逆的机械损伤;盐害假说是指低温保存过程中,细胞脱水引起溶液效应造成的损伤。针对这两种假说科学家们研发了多种保护剂,其中二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)的使用虽然大大延长了血小板的保存时间,但是保存后血小板的生物学活性与液态常温保存血小板仍然存在较大差异,损伤机制不明确。近年来有人提出“冷应激假说”,该假说认为当细胞遭受温度骤变时,细胞会发生氧化应激反应,释放大量的活性氧类物质(reactive oxygen species,ROS),诱导细胞发生凋亡。低温条件下血小板损伤是否与“冷应激”存在关联?有待进一步探索。FDA尚未批准-80℃冰冻保存的血小板运用于临床,一方面是因为冰冻后的血小板功能下降明显,另一方面保护剂DMSO尚未批准用于临床输注。毒理学研究表明,DMSO是一种微毒类的化学试剂。大量的毒性实验主要围绕口腔、皮肤和吸入三种途径展开,而6%DMSO冰冻保存的血小板进行静脉输注后,对人体血液系统(红细胞、血小板和血管内皮细胞)和代谢脏器的影响尚未有研究报道。针对低温损伤问题,本课题通过研究低温处理后血小板是否产生ROS及ROS产生部位,确定其对血小板产生的氧化损伤,揭示低温损伤过程中血小板凋亡的机制,探讨ROS靶向抑制剂对冰冻血小板的保护作用;针对DMSO的毒性问题,本课题通过研究DMSO对人体红细胞溶血、血小板功能和血管内皮细胞增殖与凋亡的影响以及DMSO对小鼠代谢脏器的毒副作用,揭示冰冻血小板输注前去除DMSO的必要性,最终为研发血小板的低温保护剂及推进解冻后去除DMSO的血小板输注提供理论基础。本课题研究内容分为以下两个部分:一、低温条件下血小板氧化损伤机制的研究1、低温和ROS对血小板凋亡的影响:本研究以22℃为对照组温度,选取了4℃、0℃、-20℃、-30℃和-80℃为低温组温度,作用时间为2h。低温组血小板PS外翻率增加,线粒体膜电位下降,说明低温诱导了血小板的凋亡;在过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)和叔丁基过氧化氢(tert-butyl hydroperoxide,TBHP)两种ROS类物质作用30min后,血小板的凋亡率随着氧化剂浓度的增加而增加。研究结果表明:低温和ROS类物质均能引起血小板凋亡的增加,两者之间是否存在着必然的联系有待进一步研究。2、低温条件下血小板ROS的生成及主要来源:采用ROS不同抑制剂二苯基碘酰氯(diphenyleneiodonium chloride,DPI)、N-硝基-L-精氨酸甲酯(nω-nitro-l-arginine methyl ester hydrochloride,L-NAME)、N-乙酰半胱氨酸(n-acetyl-l-cysteine,NAC)和线粒体靶向ROS拮抗剂Mito-TEMPO作用血小板,采用DCFH-DA和线粒体ROS靶向的Mito SOXT M Red两种荧光探针来确定低温处理后血小板内ROS的生成及主要来源,结果显示低温处理后血小板内ROS生成呈增加趋势,相比于前三种抑制剂,线粒体ROS靶向抑制剂Mito-TEMPO能更有效地抑制ROS的产生,确定了ROS主要来源为线粒体。同时,低温也会导致ROS清除剂锰超氧化物歧化酶(manganese super oxide dimutese,Mn SOD)蛋白含量和活性降低,导致ROS的降解减少。3、线粒体ROS对血小板损伤的研究:通过检测血小板膜脂质过氧化产物丙二醛(malondialdehyde,MDA)水平和线粒体心磷脂过氧化程度来确定ROS对血小板产生的损伤,结果显示,与22℃组相比,低温组MDA水平升高,心磷脂过氧化程度增加;Mito-TEMPO通过降低MDA水平和心磷脂过氧化显著抑制了血小板的氧化损伤。同时,本研究还检测到低温组血小板的PS外翻增加、线粒体膜电位下降以及GPIbα脱落增加,Mito-TEMPO显著抑制了血小板的凋亡和GPIbα蛋白的脱落。4、低温引起血小板损伤机制的研究:低温处理血小板后,尤其当温度低于0℃以下时,血小板细胞色素C(cytochrome C,cty C)从线粒体大量释放到胞浆内,而胞浆中的Bcl相关蛋白X(Bcl-2-associated protein X,Bax)也易位至线粒体,启动了血小板的线粒体凋亡途径,半胱天冬酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase-3,caspase-3)被大量激活,引起血小板凋亡事件的发生。在加入Mito-TEMPO后caspase-3的活化受到抑制,说明线粒体来源的ROS在低温诱导的血小板凋亡中起着非常重要的作用。二、血小板冰冻保护剂DMSO的毒副作用初探1、DMSO对人红细胞的影响:本研究采用体外溶血实验的方法,检测了不同浓度DMSO(0.2%,0.4%和0.6%)作用于红细胞后,游离血红蛋白(plasma free hemoglobin,FHb)含量的变化,结果表明随着DMSO浓度的增加、作用时间的延长,FHb含量呈现增加趋势,同时检测红细胞的凋亡率未发现明显异常,提示DMSO对红细胞引起的损伤是小分子化合物渗透作用直接导致的非免疫性溶血损伤,并没有启动细胞凋亡程序。2、DMSO对人血小板的影响:通过光学法和全血电阻法检测了DMSO对血小板聚集功能的影响,结果表明DMSO显著抑制了ADP、凝血酶受体激活肽和凝血酶诱导的血小板聚集,起始浓度分别为0.5%、0.25%和2%,当DMSO浓度达到6%时,血小板的聚集抑制率高达90%以上。同时,DMSO还降低了与血小板酶促荧光反应活性和内源性凝血酶水平。3、DMSO对血管内皮细胞的影响:0.2%,0.4%和0.6%DMSO连续作用于血管内皮细胞系Eahy926细胞5d后,结果发现DMSO通过阻滞G1期抑制血管内皮细胞的增殖,同时DMSO还增加了Eahy926细胞的凋亡率,均呈现时间-量效关系。4、动物实验:6%DMSO(150μl、300μl)连续尾静脉输注5d,与对照组(没有任何处理)相比,输注DMSO的小鼠食欲不振,体重增加缓慢,但观察小鼠的肝、肾功能及病理切片未见明显异常,可能因给药剂量小、时间短,对肝肾产生的毒副作用不明显。综上所述,低温处理后血小板线粒体来源ROS通过线粒体凋亡途径引起血小板凋亡增加,线粒体ROS靶向抑制剂Mito-TEMPO通过抑制ROS水平来降低血小板的PS外翻率、提高线粒体膜电位、降低血小板的氧化损伤从而起到保护血小板的作用。体外实验证实保护剂DMSO可引起红细胞溶血,抑制血小板的聚集功能,通过阻滞G1期抑制血管内皮的增殖、促进血管内皮细胞的凋亡。本研究揭示了血小板低温损伤的机制,为冰冻血小板保护液配方的研制提供新的思路和理论基础;针对DMSO的毒性本课题组自主研发了透析式冰冻血小板处理机(专利号:201320735032.7),利用肾透析原理在去除DMSO的同时保证血小板的功能,相关实验已经开展,最终目的是为临床和战伤救治提供安全有效的血小板制品。
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R457.1

【参考文献】

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1 袁晓华;;细胞冷冻冰晶损伤和应激损伤机理[J];生命的化学;2009年04期

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本文编号：1280807