NCAPH在人结直肠癌中的功能作用及其相关分子生物学机制研究

发布时间：2017-12-13 14:37

  本文关键词：NCAPH在人结直肠癌中的功能作用及其相关分子生物学机制研究

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【摘要】：[目的]收集昆明地区87例人结直肠癌病例资料及组织标本,用免疫组化法检测肿瘤组织及正常组织中非SMC凝集蛋白1复合物亚基H(NCAPH)的表达水平并分析其表达水平与患者年龄、性别、肿瘤分化程度、肿瘤分期、肿瘤位置及生存预后的关系,初步探索NCAPH在人结直肠癌中的功能作用。随后在细胞水平上,运用基因干扰的方法研究NCAPH基因对人结肠癌细胞系HCT-116的增殖、迁移及凋亡的影响;并在细胞水平探索NCAPH基因对人结肠癌细胞系HCT-116中上皮间充质转化途径的影响,以探讨NCAPH基因在结肠癌生长、增殖及发病机制中的作用。最后,在动物水平上,建立裸鼠荷人结肠癌皮下移植瘤模型,探索NCAPH基因对人结肠癌Balb/c裸鼠皮下移植瘤生长的影响。[方法]1.收集昆明医科大学附属第一医院肿瘤科2011年1月-12月诊治的结直肠癌手术患者的肿瘤组织和正常组织标本蜡块,采用免疫组织化学方法分别检测87例结直肠癌组织和正常组织中NCAPH的表达水平。运用SPSS20.0统计软件包进行数据分析。计数资料采用率、构成比描述;计量资料正态分布用X±S,偏态分布资料采用M±Q描述:计量资料正态分布多组间比较采用方差分析(ANOVA),无序分类资料的差异比较采用X2检验;二分类等级资料比较采用Mann-Whitney秩和检验(U检验),多分类等级资料比较采用Kruskal-Wallis秩和检验(H检验),生存分析采用Kaplan-Meier法,患者生存多因素分析用Cox回归。分析NCAPH的表达量与结直肠癌患者年龄、性别、肿瘤分化程度、肿瘤分期、肿瘤位置及生存预后的关系。2.首先用invitrogen公司的在线设计软件设计3条NCAPH-siRNA,细胞转染后用实时荧光定量PCR和Western Blot技术验证每条NCAPH-siRNA的干扰效率,并选出效果最好的一条进行后续试验。随后实验分为3组:对照组(正常细胞)、阴性对照组(转染试剂处理)、NCAPH干扰组(NCAPH-siRNA处理)。采用CCK-8方法检测各处理结肠癌细胞的增殖情况;用Transwell小室和细胞划痕实验检测结肠癌细胞的迁移情况;并用流式、qPCR和Western Blot方法检测结肠癌细胞凋亡的情况。3.为了探索NCAPH促进结肠癌细胞增殖的机制,我们选择上皮间充质转化(EMT)途径相关蛋白进行进一步研究。采用qPCR和Western Blot技术分析上皮标志基因E-cadherin和β-catenin,以及间充质标记基因Fibronectin和Vimentin的表达情况;并用免疫荧光技术检测E-cadherin和Fibronectin蛋白在细胞中的表达水平,以研究NCAPH对结肠癌细胞中上皮间充质转化的影响。4.将不同处理的HCT-116细胞,分别在裸鼠腋下皮下注射约108个细胞,培养21天,建立人结肠癌裸鼠皮下移植瘤模型。分别在1、5、10、14和21天观察并测量每组裸鼠瘤块体积的大小,并在21天时取出肿瘤称重并拍照,用HE染色检测肿瘤组织的病理特征,用免疫组化技术检测肿瘤组织中NCAPH蛋白的表达情况。[结果]1.免疫组化结果显示,NCAPH蛋白在本组人结直肠癌肿瘤组织中的表达具有特异性(P=0.006)。NCAPH表达(+++)的患者年龄较大(P0.05)且在低分化腺癌中出现比率较高(P=0.027);在右半结肠尤其是升结肠组织中有高表达趋势,但因右半结肠病例数较少,未体现出统计学差异,需进一步扩大样本量验证其特异性(P=0.067);NACPH低表达(-,+)患者的生存期要高于高表达的患者(++,+++)(P=0.001);Cox回归显示,本组患者的肿瘤位置(左半结肠、右半结肠)(P=0.009),肿瘤分期(P=0.013)及NCAPH表达强度(P=0.005)是其生存的主要影响因素。2.干扰验证结果显示,NCAPH siRNA-2可以显著地抑制NCAPH在HCT-116细胞中的表达,后续实验选用NCAPH siRNA-2来进行实验。CCK-8实验结果显示,与正常对照组相比,NCAPH-siRNA明显降低了 HCT-116细胞的细胞活力(P0.001),阴性对照组与正常对照组相比,没有显著差异(P0.05)。细胞迁移划痕实验显示,与正常对照组相比,NCAPH-siRNA明显抑制了 HCT-116细胞的迁移(P0.001),阴性对照组与正常对照组相比,没有显著差异(P0.05)。细胞凋亡检测结果显示,与正常对照组相比,NCAPH-siRNA明显诱导了HCT-116细胞发生了凋亡(P0.001);阴性对照组与正常对照组相比,没有显著差异(P0.05):NCAPH-siRNA明显促进了促凋亡蛋白Bax的表达(P0.001),而抑制了抗凋亡蛋白Bcl-2的表达(P=0.0119,P0.05)。3.实时荧光定量PCR和Western Blot结果显示,NCAPH干扰后,上皮标记基因E-cadherin和β-catenin的表达量被明显增加,而间充质标记基因Fibronectin和Vimentin的表达量被明显减弱。E-cadherin和Fibronectin蛋白在各组中免疫荧光的结果与前面实时荧光定量PCR和Western Blot结的结果一致。正常对照组和阴性对照组之间,没有明显变化。4.在裸鼠成瘤试验中,正常对照组和阴性对照组的肿瘤生长迅速,21天时肿瘤直径达15mm左右,重量在180mg左右,而NCAPH干扰组的肿瘤生长明显减慢,重量明显减轻。HE结果显示,NCAPH干扰组的肿瘤组织中细胞增殖被显著抑制。免疫组化的结果显示,在正常对照组和阴性对照组中,NCAPH蛋白染色强度比NCAPH干扰组中的强,这说明抑制NCAPH表达可以减慢结肠癌细胞的生长。[结论]1.在本组患者中,相较正常组织,NCAPH在结直肠癌组织中的表达具有特异性;而且相较左半结肠其在右半结肠组织尤其是升结肠中有高表达趋势,但需进一步扩大样本量验证其特异性·,通过生存分析,NACPH表达与患者预后呈负相关,这可能与NCAPH在高龄患者及低分化腺癌患者中高表达(+++)的比率较高有关;Cox回归显示,肿瘤位置,肿瘤分期及NCAPH表达强度是本组患者生存的主要影响因素;2.运用RNA干扰技术,获得NCAPH高效率干扰片段。并通过研究发现NCAPH基因干扰后,结肠癌细胞系HCT-116的增殖和迁移能力被显著抑制,并诱导了结肠癌细胞发生凋亡。这说明NCAPH能够促进结肠癌细胞系HCT-116的增殖和迁移能力,并抑制结肠细胞凋亡;3.对上皮间充质转化相关蛋白的研究结果发现,NCAPH基因干扰后,显著增加了上皮标记基因(E-cadherin和β-catenin)的表达,明显减少了间充质细胞标记基因(Fibronectin和Vimentin)的表达,这说明EMT过程被明显抑制。这表明了,NCAPH可能通过促进结肠癌发生上皮间充质转化来发挥促进结肠癌生长增殖的作用。但需进行进一步的信号通路检测试验来进行验证,同时进行动物水平功能验证。4.裸鼠成瘤实验结果表明,NCAPH表达抑制的结肠癌细胞裸鼠成瘤速度和瘤体大小明显被减弱,大大地抑制结肠癌细胞的增殖,抑制了肿瘤生长。这结果都说明了 NCAPH基因可以促进结肠癌细胞的生长和增殖,NCAPH基因与结肠癌的发生和生长有着密切的关系。
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.34

【参考文献】

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本文编号：1285535