向日葵花盘抗肿瘤有效组分筛选及其活性机制研究

发布时间：2017-12-15 07:19

  本文关键词：向日葵花盘抗肿瘤有效组分筛选及其活性机制研究

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【摘要】：向日葵在我国种植广泛,向日葵花盘、叶、茎秆等副产品资源来源丰富,但一般都作为饲料、燃料或废弃物处理,不但污染环境,而且严重浪费资源,工业附加值极低。在传统中医药领域中向日葵具有极高的药用价值,全株均可入药,具有防治癌症、降血压、提高免疫力等多种疗效,目前对其药用组分及相关功能活性的确证研究稀少。因此,研究和开发向日葵资源药用组分,对于深入探索向日葵药用组分的活性功能,促进向日葵资源中药现代化利用具有重要意义。本文研究了向日葵(除籽之外)资源药用组分分布和积累规律,针对向日葵抗肿瘤活性组分进行了筛选,并对其抗肿瘤活性作用机制进行了研究,以期对向日葵药用资源和抗肿瘤活性组分的开发利用提供依据,主要研究结果如下：(1)以总多酚、总黄酮、总多糖和绿原酸为研究目标,对向日葵各个生长阶段的药用组分在植株内的分布和积累规律进行研究,结果表明,以多糖为采收目的物质应选择成熟期花盘,除此之外,向日葵药用资源的采集应首选花期的向日葵花盘和现蕾期的叶。(2)采用匀浆萃取法分别制备了报道或验方中提及的具有抗肿瘤活性的向日葵植株部位——根、茎髓和花盘总提取物,其中花盘总提取物得率最高,为13.33%。对向日葵花盘提取物按照极性大小进行分级处理,获得了二氯甲烷萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水萃取物4个极性段萃取物,其中水萃取物得率最高,其次为二氯甲烷萃取物。(3)通过MTT法和S180荷瘤鼠模型考察了向日葵根、茎髓和花盘总提取物,以及向日葵花盘二氯甲烷萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水萃取物4个极性段萃取物的体外和体内抗肿瘤活性,结果表明,花盘总提取物的体外和体内抗肿瘤活性是各部位提取物中最好的,而二氯甲烷萃取物的体外和体内抗肿瘤活性均优于向日葵花盘提取物,因此判断二氯甲烷萃取物是向日葵花盘提取物中抗肿瘤活性最好的药用组分。(4)通过人类胃癌细胞SGC-7901细胞增殖实验、荧光显微镜观察、流式细胞术法以及Western-blot法研究了向日葵花盘二氯甲烷萃取物(HHDE)的抗肿瘤作用机制,结果表明,HHDE具有显著的抑制肿瘤细胞增殖活性,且其抗肿瘤活性的剂量相关性显著大于时间相关性,作用浓度≥0.25mg/mL时24h即可显著抑制肿瘤细胞生长,抑制率≥58%。伴随着HHDE浓度的增加,倒置显微镜和荧光显微镜均可以观察到剂量相关的细胞凋亡形态学改变,Annexin-V-FITC/PI法和细胞周期检测结果均显示肿瘤细胞出现了显著的凋亡,同时线粒体膜电位下降,ROS、Ca2+水平显著升高。Western-blot结果显示线粒体内的细胞色素C表达下降,细胞质内的细胞色素C表达增加,表明细胞色素C由线粒体释放到细胞质内,同时Caspase-3、Caspase-9前体蛋白表达下降,证明Caspase-3、Caspase-9已经被激活。另外,Bc1-2蛋白表达下降,Bax蛋白表达上升,Bax/Bcl-2比例上升。综合以上实验结果,HHDE抗肿瘤作用机制主要是通过线粒体途径诱导细胞凋亡而实现的。(5)通过液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS)法对HHDE的化学成分进行了研究,结果表明HHDE中可能含有包括8个倍半萜类化合物,6个二萜类化合物的14种化合物成分,其中文献报道grandifloric acid具有显著抗肿瘤活性,其余化合物未见相关报道。(6)通过气相色谱质谱联用(GC-MS)法从HHDE中鉴定出35种化合物,占HHDE总挥发性物质的93.26%。含量最高的8种化合物占HHDE总挥发性物质的63.26%。综合文献调研结果,并通过MTT法验证茴芹内酯、海松酸和β-谷甾醇的体外抗肿瘤活性,结果显示三种化合物是向日葵花盘中的有效抗肿瘤成分,且茴芹内酯和海松酸的体外抗肿瘤活性大于HHDE。综上所述,向日葵花盘是药用组分在向日葵植株内的主要分布器官。向日葵花盘总提取物的二氯甲烷萃取物具有显著的抗肿瘤活性,且活性作用机制明确。因此有效地开发向日葵花盘抗肿瘤药用组分,促进向日葵药用资源中药现代化应用,具有重大的经济效益和社会效益。
【学位授予单位】：东北林业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R284;R285

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本文编号：1291074