抗EV71病毒MAPK信号通路抑制剂的筛选及抗病毒作用的研究

发布时间：2017-12-15 20:00

  本文关键词：抗EV71病毒MAPK信号通路抑制剂的筛选及抗病毒作用的研究

  更多相关文章： EV71 MAPK 小分子抑制剂 抗病毒治疗

【摘要】：EV71(肠道病毒71型,Enterovirus 71)是手足口病的主要病原体之一,通常感染婴幼儿,对其生命健康具有较大的危害。尽管绝大多数情况下EV71感染所引发的疾病具有可自愈的特点,但发生重症感染时,EV71能够激活患儿体内的炎症因子风暴,导致脑炎、神经源性肺水肿、无菌性脑膜炎等其他致命性严重疾病的发生。目前,临床上还没有开发出针对重症感染的特效治疗药物。EV71的感染和复制需要MAPK(丝裂原活化蛋白激酶,mitogen-activated protein kinase)信号通路的激活,尤其是p38-MAPK信号通路,该通路对于EV71复制具有重要作用。MAPK信号通路小分子抑制剂具有出色的抗炎作用,在临床试验中被广泛应用于多种炎性疾病的治疗。考虑到EV71重症感染引发的炎症疾病,MAPK信号通路抑制药物可能能在应对EV71感染方面发挥抗病毒作用。本研究旨在筛选出具有抗EV71病毒效果的MAPK信号通路小分子抑制剂,在体内外评价药物的抗病毒作用,并探索药物的抗病毒机制。首先对包含有65种小分子抑制剂的MAPK化合物库进行筛选。病毒感染后的RNA拷贝数检测结果表明多种MAPK信号通路抑制剂表现出抑制EV71病毒复制的作用。其中,AS602801、PD169316、BRAF inhibitor、GW5074和TAK-632均能将EV71外壳蛋白VP1的RNA拷贝数抑制为对照的10%以下。p38抑制剂PD169316展现出了显著的抗病毒效应(抑制后病毒拷贝数仅为对照的2%)。PD169316与研究中普遍使用的p38抑制剂SB203580有着相似的化合物结构,然而,PD169316抑制EV71病毒复制的效果要显著优于SB203580。EV71感染24h后,5μM、10μM、20μM的PD169316能将EV71 VP1 RNA拷贝数抑制为对照的11.13%、13.65%和0.2%,而相应浓度的SB203580抑制的结果仅为65%、70%和48%。同时,EV71 VP1的蛋白水平也显著下调。EV71感染低表达p38α的HeLa细胞时,复制水平显著低于感染正常HeLa细胞。此外,细胞毒性试验表明20μM的PD169316对RD细胞没有表现出细胞毒效应。为了考察这些小分子抑制剂在动物模型中的抗EV71病毒效果,建立了EV71攻毒致死乳鼠模型。动物感染实验结果显示,EV71 GDV103株攻毒1日龄昆明乳鼠和3周龄NOD-SCID(非肥胖糖尿病-重症联合免疫缺陷,non-obese diabetic severe combined immunodeficient)免疫缺陷小鼠时,都没有表现出明显临床病症,因此使用EV71 MA鼠适应株进行抑制剂抗病毒作用的评价。EV71 MA感染乳鼠后引发的主要症状是四肢麻痹,症状严重时可致死。骨骼肌组织是EV71 MA感染后主要富集的区域。通过在乳鼠体内连续传代的方式增强该病毒株的毒力后,采用7日龄昆明乳鼠作为EV71 MA攻毒动物模型。EV71 MA以106 pfu/只的剂量颅内感染昆明乳鼠后,使用筛选出的抑制剂以1mg/kg的剂量每天进行肌肉注射。生存曲线的结果表明所有药物组中只有PD169316治疗的乳鼠存活率要高于DMSO(二甲基亚砜,dimethyl sulfoxide)对照组。PD169316治疗组乳鼠的存活率达到70%,而DMSO对照组的存活率仅有40%。PD169316组的乳鼠其死亡时间明显晚于对照。临床评分结果显示,对照组的乳鼠在感染后第5天普遍出现单肢麻痹的轻微病症,感染后第9天达到发病高峰,主要表现为四肢麻痹和死亡;而PD169316治疗组的乳鼠在感染后第9天普遍出现双肢麻痹症状。感染后11天,PD169316治疗乳鼠的病症有所恢复,评分结果显著优于DMSO对照组。除了生存曲线和临床评分的表现外,还在其他方面评价了PD169316的体内抗病毒效果。通过检测组织中的病毒RNA水平、病毒滴度及病毒抗原水平,结果显示PD169316显著降低了EV71在乳鼠骨骼肌中的复制水平。通过HE(苏木精-伊红,Hematoxylin and Eosin)染色对组织病理情况进行检查,结果表明,DMSO组乳鼠的脑部存在片状出血的现象,PD169316组乳鼠脑部则没有病理改变。DMSO组乳鼠肠组织中有明显的粘膜下炎性细胞浸润表现,而PD169316组则没有观察到明显的炎性细胞浸润表现。DMSO组乳鼠骨骼肌组织中可以观察到明显变性、水肿、出血及炎性细胞浸润,部分区域可见坏死改变,且病变分布弥漫,而PD169316组中炎性浸润和坏死症状都得到了有效的缓解。使用流式细胞术检测乳鼠血清中炎症因子的变化情况,结果显示,EV71感染后第5天,PD169316组乳鼠血清中TNF-α(肿瘤坏死因子α,tumor necrosis factor-α)和MCP-1(单核细胞趋化蛋白-1,monocyte chemotactic protein 1)的水平显著低于DMSO对照组。综上所述,PD169316能够有效地抑制EV71在乳鼠体内的复制,降低炎症因子的分泌水平。通过进一步探索PD169316的抗病毒机制,发现EV71的复制是p38分子激活所必须的。EV71的单个蛋白,包括4个结构蛋白(VP1、VP2、VP3、VP4)和7个非结构蛋白(2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D)不能激活p38分子。β-丙内酯灭活处理的EV71也不能激活p38-MAPK。同时,病毒复制是EV71诱导的caspase-3细胞凋亡所必须的。而流式细胞术和Western blotting检测结果均表明,PD169316可显著抑制EV71诱导的细胞凋亡,且该抑制作用具有明显的剂量依赖效应,乳鼠骨骼肌的免疫组化实验也获得了相似的结论。STAT1(signal transducers and activators of transcription 1,信号转导及转录激活因子1)的磷酸化是细胞凋亡中的重要环节,PD169316可抑制STAT1Ser727磷酸化和后续的细胞凋亡。使用si RNA敲低STAT1蛋白表达,进而降低STAT1Ser727磷酸化水平后,发现caspase-3、caspase-8和caspase-9的剪切水平都明显下调。这些结果说明p38/p-STAT1Ser727信号通路参与了对EV71诱导的宿主细胞凋亡的调控工作。为了说明PD169316是否通过降低细胞凋亡水平来抑制EV71复制,使用caspase-3特异性的抑制剂DEVD-CHO对caspase-3蛋白的激活进行抑制。结果显示,当细胞凋亡被抑制后,EV71的复制水平并没有下调。这说明PD169316的抗病毒作用不依赖于caspase-3介导的细胞凋亡。综上所述,本研究筛选到的p38 MAPK抑制剂PD169316具有显著的抗EV71病毒活性,并在细胞水平和乳鼠模型中验证了其抗病毒效果。EV71复制过程激活p38-MAPK信号通路,诱导宿主细胞凋亡的发生,p38/STAT1Ser727信号通路可能参与调控该过程。Caspase-3介导的细胞凋亡受抑制不影响EV71的复制。本工作为EV71治疗药物的研发提供了一种新选择。
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R373.2

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 韩萍萍;郑若男;;Wnt信号通路及其与疾病的关系[J];生物技术通报;2009年11期

2 王春梅,姜涛,周春燕;诱导心脏发生的早期信号通路[J];中国生物化学与分子生物学报;2004年05期

3 吴小萍;陈晓萍;斯f亮;;丝裂原活化蛋白激酶信号通路相关研究[J];生物学通报;2006年06期

4 刘红标;刘娟;;蛋白质相互作用网络中信号通路的识别算法[J];武汉大学学报(理学版);2008年03期

5 黎增辉;廖爱军;;JNK信号通路[J];国际病理科学与临床杂志;2010年03期

6 李春艳;高宁;侯颖春;;经典Wnt信号通路与人类肿瘤[J];中国生物化学与分子生物学报;2014年05期

7 郭陈智;范华骅;;Wnt信号通路参与外周免疫调节的研究进展[J];生命科学;2010年04期

8 孙小妹;毛萌;;脑源性神经营养因子诱导的丝裂原活化蛋白激酶信号通路[J];生物医学工程学杂志;2006年04期

9 尹力,柳惠图,王端顺;微丝重组对DG-PKC信号通路的作用[J];科学通报;1994年16期

10 过倩萍;邢欣荣;伍会健;;蛋白质修饰对Wnt信号通路的调控[J];中国生物化学与分子生物学报;2009年02期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 程华;王文;;经典Wnt信号通路抑制剂[A];2011全国老年痴呆与衰老相关疾病学术会议第三届山东省神经内科医师（学术）论坛论文汇编[C];2011年

2 蒋莹;程华;张丽;艾厚喜;王文;;经典Wnt信号通路抑制剂[A];第一届全国麻醉药理专业委员会第二次学术会议论文集[C];2011年

3 蒋莹;程华;张丽;艾厚喜;王文;;经典Wnt信号通路抑制剂[A];中国成人医药教育论坛（4）[C];2011年

4 蒋莹;程华;张丽;艾厚喜;王文;;经典Wnt信号通路抑制剂[A];中国药理学会补益药药理专业委员会成立大会暨人参及补益药学术研讨会会议论文集[C];2011年

5 李艳菲;艾厚喜;孙芳玲;张丽;蒋莹;王文;;Wnt信号通路研究新进展[A];2013年中国药学大会暨第十三届中国药师周论文集[C];2013年

6 李艳菲;艾厚喜;孙芳玲;张丽;蒋莹;王文;;Wnt信号通路研究新进展[A];2013年全国老年性痴呆与相关疾病学术会议论文汇编[C];2013年

7 李艳菲;艾厚喜;孙芳玲;张丽;蒋莹;王文;;Wnt信号通路研究新进展[A];第三届中国药理学会补益药药理专业委员会学术研讨会论文集[C];2013年

8 季宇彬;胡哲清;邹翔;;MAPK信号通路及其研究进展[A];转化医学研讨会论文集[C];2010年

9 程华;孙芳玲;艾厚喜;张丽;蒋莹;王文;;Wnt信号通路与血管发生[A];全国第三次麻醉药理学术会议论文集[C];2012年

10 李林;;利用小分子探针研究经典Wnt信号通路的信号转导机制[A];中国生物化学与分子生物学会第十一次会员代表大会暨2014年全国学术会议论文集——专题报告七[C];2014年

中国重要报纸全文数据库 前6条

1 刘海英;美发现两种细胞信号通路互动机制[N];科技日报;2009年

2 记者 刘海英;英发现细胞信号通路新“刹车”蛋白[N];科技日报;2012年

3 衣晓峰　陈英云 记者 李丽云;结肠癌发生中新的信号通路找到[N];科技日报;2009年

4 记者 许琦敏;减肥信号受控于脑中“通讯员”[N];文汇报;2008年

5 记者 刘海英;一种蛋白决定人的抗压能力[N];科技日报;2011年

6 通讯员 乔蕤琳 记者 衣晓峰 聂松义;癌症中小分子和微小核苷酸有关联[N];健康报;2012年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 王森;乙型肝炎病毒表面抗原抑制TLR2和TLR4信号通路的机制研究[D];复旦大学;2014年

2 尚果果;NRF2抗氧化应激信号通路的活化在糖尿病肾病中的保护作用及其机制研究[D];复旦大学;2014年

3 孙鼎琪;Akt信号通路在膀胱肿瘤的进展及化疗敏感性的实验研究[D];山东大学;2015年

4 白秀峰;新基因Gsdma3对小鼠毛囊周期及Wnt/β-catenin信号通路作用的研究[D];第三军医大学;2015年

5 张俊波;PI3K/Akt信号通路调控胞内布鲁氏菌16M存活的分子机制研究[D];石河子大学;2014年

6 成旭东;黄芪活性物质筛选及基于PKC-ERK信号通路抑制肺癌的作用机理研究[D];南京中医药大学;2015年

7 路康;STAT3信号通路介导CLL和MCL发生组蛋白去乙酰化酶抑制剂耐药的机制研究[D];山东大学;2015年

8 赵睿;Wnt信号通路在臂丛神经根性撕脱伤诱发的神经病理性痛中的作用机制研究[D];第四军医大学;2015年

9 刘海燕;Sonic hedgehog信号通路对正常角质形成细胞增殖及凋亡的影响及其分子机制[D];第四军医大学;2015年

10 祁义军;胃肠道间质瘤中Shh信号通路作用的实验研究[D];安徽医科大学;2015年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 韩绍芳;小鼠主要嗅觉表皮组织内AC3缺失对相关因子及信号通路的影响[D];河北大学;2015年

2 李玉娟;Hedgehog信号通路在大鼠急性胰腺炎中的作用及其对TNF-α、IL-10的影响[D];河北医科大学;2015年

3 赵玲玲;FLCN与PAT1相互作用调控mTORC1信号通路的机理研究[D];西北农林科技大学;2015年

4 努尔古丽·苏里坦;mir-260和mir-240调控钱虫寿命的研究[D];华中师范大学;2015年

5 王瑜;晚期糖基化终末产物和骨髓间充质干细胞对血管内皮细胞VEGF信号通路的影响及其机制探讨[D];河北医科大学;2015年

6 杨莹莹;microRNA-203通过APC介导活化Wnt/β-catenin信号通路在佐剂性关节炎大鼠成纤维样滑膜细胞中的调控作用及机制研究[D];安徽医科大学;2015年

7 徐贞贞;PM2.5对人支气管上皮细胞JAK/STAT信号通路的影响[D];山西医科大学;2015年

8 徐国栋;芪蛭皱肺颗粒调控肺泡Ⅱ型上皮细胞NF-κB信号通路的研究[D];甘肃中医药大学(原名：甘肃中医学院);2015年

9 陆兆双;多聚左旋精氨酸促进LPS诱导的NCI-H292细胞释放炎症因子IL-6、IL-8的信号通路研究[D];安徽医科大学;2015年

10 修丽梅;P38MAPK信号通路在肢体缺血预处理脑保护中的作用[D];山西医科大学;2015年

，

本文编号：1293218