染色体改变、AZF缺失与CDK2基因在非梗阻性无精症中的研究

发布时间：2017-12-16 10:15

  本文关键词：染色体改变、AZF缺失与CDK2基因在非梗阻性无精症中的研究

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【摘要】：第一部分染色体改变、AZF缺失在非梗阻性无精症中的研究研究目的:探讨染色体核型改变与Y染色体微缺失(Y chromosome microdeletions of azoospermia factor,AZF)在中国男性非梗阻性无精子症患者(non-obstructive azoospermia,NOA)不同病理类型中分布比例,同时研究染色体核型改变、AZF缺失与正常组间生殖内分泌激素、睾丸体积及精子获取率的关系,并为这些男性不育患者提供可靠的遗传学咨询。研究方法:本研究为病例对照研究,其中病例组包括286例睾丸活检的NOA,对照组为正常生育男性100例。首先将接受睾丸活检的286例NOA患者的睾丸活检组织用Bouin氏液,固定24小时,经过取材、脱水、包埋、石蜡切片及苏木素-伊红染色后镜检后进行病理分型,分型的依据为有无精子及精子发生过程的阻滞阶段。同时,对不同病理类型的标本进行电镜超微结构观察NOA不同病理类型的生精上皮、支持细胞及间质细胞的变化。染色体核型分析通过提取外周血后进行培养,秋水仙素处理使细胞分裂停在中期并收取分裂相,通过沉淀、低渗、(预)固定等收获细胞,制片并镜检,通过染色体G显带技术分析至少20个分裂相。对286例NOA患者的AZF四个区域AZFa、AZFb、AZFc与AZFd(位于AZFb与AZFc之间)缺失进行分析时,使用标准操作流程抽取患者外周血并提取DNA后进行11个STS位点的聚合酶连反应(Polymerase chain reaction,PCR),采用正常男性和女性,分别作为阴/阳性对照,PCR反应后经1%琼脂糖加入1x TAE缓冲液并加入genecolourⅡ,室温100V,40min凝胶电泳。最后进行统计学分析,分析不同病理类型间的染色体的核型改变及AZF缺失类型,然后对不同病理类型间、染色体组与正常组之间、AZF缺失与正常组间在不同病理类型中的临床指标变化进行分析,如生殖内分泌激素的卵泡刺激素(follicle stimulating hormone,FSH)、黄体生成素(luteinizing hormone,LH)、睾酮(testosterone,T)、精子获取率(sperm retrival,SR)及睾丸体积等。研究结果:在本研究中通过镜检形态学分析,286例无精子症的患者中,包括有精子形成,但是各种生精细胞都存在数量减少伴发生精细胞紊乱的生精功能低下组(Hypospermatogenesis,HS)39例;无精子生成,生精阻滞在不同阶段的生精功能阻滞型(germ cell mature arrest,MA)48例;完全无精子发生,曲细精管中只有支持细胞的唯支持细胞综合征(Sertoli cell only syndromegerm,SCOS)199例。并通过电镜分析各种不同的病理类型均出现不同程度的生精上皮、支持细胞及间质细胞的改变,尤其是在生精功能最差的SCOS组中,电镜下可见曲细精管胶原纤维组织增生,支持细胞增生,胞浆内质网丰富,线粒体嵴消失伴发空泡变,并出现较多自噬体。在286例NOA患者中有14.30%的患者出现染色体改变。其中染色体异常8例(MA2例,SCOS 6例),包括常染色体改变有2例(MA 1例,SCOS1例),性染色体改变患者有6例(包括SCOS组4例克氏综合征(47,XXY)和2例嵌合体(MA 1例,SCOS 1例))。染色体多态发生在对照组的比例是30%,而发生在NOA组的比例为11.5%。在不同病理类型组中,SCOS组:6例伴有染色体核型改变(其中包括1例常染色体异常和5例性染色体异常(以克氏综合征为主);染色体多态性改变的有26例,其中以Y染色体的多态为主(6例为Yqh-)。MA组:7例(14.6%)伴有染色体改变(其中1例为常染色体异常,1例为性染色异常及5例染色体多态改变,且以Y染色体多态改变为主)。HS组:有2例(5.1%)伴有染色体改变,且均为Y染色体多态性改变。染色体核型改变在HS,MA及SCOS三组内无明显统计学差异(P=0.213)。45例(15.7%)NOA患者发生AZF缺失,其中最常见的缺失类型为AZF(c+d)。在不同病理类型中,SCOS组:24例AZF缺失(24/199,12.1%),其中2例AZFa缺失,1例AZFc缺失,1例AZFd缺失,9例AZF(c+d)缺失,11例AZF(b+c+d)缺失(为主要缺失类型);MA组:19例 Z 缺失(19/48,39.6%),其中1例 缺失,4例 AZFc缺失,2例AZF(b+c)缺失,1例AZF(b+d)缺失,7例AZF(c+d)缺失(最主要缺失类型),4例AZF(b+c+d)大片段缺失;HS组:2例AZF缺失(2/39,5.1%),均为AZF(c+d)缺失,三组之间有显著性差异(x 2=25.926,P0.001)。同时本研究中发现AZF缺失伴发染色体核型改变有14例(3.6%)(SCOS组有10例,MA组有4例)。以AZF(b+c+d)大片段缺失联合染色体改变多见(最常见于SCOS组中)。精子获取率(Sperm retrieval,SR)在不同病理类型间有明显差异(P0.001)。SR在HS比例明显高于其他两组病理类型;而SR在染色体异常组与正常组,及AZF缺失组与正常组的组间均无明显统计学差异。结论及意义:本研究首次对细胞遗传学因素(染色体核型和AZF缺失)在经睾丸活检的NOA不同病理类型中的分布进行研究,发现在NOA患者中,尤其是在生精功能较差的SCOS中,细胞遗传学改变比例较高,通过染色核型改变及AZF缺失分析研究可以更好地了解男性不育的不同病理类型的细胞遗传学病因学并给予上述患者可靠的遗传学咨询,为伴有染色体核型改变或者AZF缺失的患者选择合适的辅助生殖技术,并避免辅助生殖技术引起遗传学的垂直传播。第二部分CDK2基因在特发性非梗阻性无精症中的研究实验目的:无精子症占男性不育的10%?20%,其中约40%生精功能障碍病因未知,又被称作特发性无精子症。研究证实,男性不育是具有遗传基础的复杂疾病,基因异常可发生在男性不育各个阶段,而减数分裂是正常精子生成过程的重要环节,过程受到许多基因精密调控,细胞依赖蛋白酶2(Cyclin dependent kinase 2,CD2)基因表达于精母细胞减数分裂的全过程,且在小鼠动物模型中证实缺失能够引起雄性小鼠不育,但是目前国内外尚无CDK2基因在男性无精子症人群方面的研究。本研究旨在探讨中国汉族不明原因NOA病理类型是否与CDK2基因突变相关。实验方法:本研究选取特发性NOA患者为病例组,提取外周血基因组DNA,应用PCR扩增CDK2基因的7个外显子及相应侧翼序列,并对其产物进行测序,并分析CDK2基因是否存在异常碱基改变、插入或缺失。同时与NCB1提供的正常序列对照组比较。实验结果:本研究中的NOA,包括HS 48例,MA 40例。结果未发现新发突变,在CDK2基因的7个外显子中发现4个已知SNPs位点(4个已知SNPs分别是外显子1中的c.324GA,外显子2中的c.363TC,and3'UTR区的c.*570GA和c.*1160G〉C),并对上述位点进行关联分析,等位基因频率和基因型频率在病例组与对照组相比校无明显差异,通过进一步病理分型后,将HS和MA组分别与对照组进行比较,等位基因频率和基因型频率均无差异。实验结论:在本研究未发现新发突变,结果提示本地区男性特发性非梗阻无精子症病理类型与CDK2基因编码区序列改变可能是不相关,特发性NOA病因有待进一步深入研究。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R698.2

【参考文献】

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1 刘雯;李婷;于瑞梅;解磊;高选;;147例唯支持细胞综合征患者的睾丸病理分型和性激素分析[J];山东大学学报(医学版);2017年01期

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本文编号：1295649