乳腺癌相关的新型人雌激受体hERα剪接变体ERα30的克隆及其功能和作用机制的研究

发布时间：2017-12-16 22:34

  本文关键词：乳腺癌相关的新型人雌激受体hERα剪接变体ERα30的克隆及其功能和作用机制的研究

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【摘要】：选择性剪接从相同的基因产生许多不同的mRNA(剪接变体),使得有限数量的基因可以编码多种不同的蛋白质。越来越多的证据表明,剪接变体在癌症的发展,临床诊断和治疗中均具有重要作用。从20世纪90年代初到现在,研究者们已经发现许多人雌激素受体α(hERα)剪接变体,大多数具有一个或多个外显子的缺失并且可以表达为蛋白质。有的剪接变体可调控全长型hERα(ERα66)的功能。它们在乳腺癌的形成和进展期间可能变得异常,从而通过某些未知的机制对乳腺癌细胞的行为产生影响,并且可以促进乳腺癌的进展,例如失去对抗雌激素治疗反应性。本研究首先从一例三阴性乳腺癌组织中发现并克隆了一种新的hERα剪接变体,命名为ERα30。该剪接变体的剪接方式较为特殊,将hERα基因外显子4的前24bp直接剪接至外显子6的最后44bp。由于外显子5和外显子7的完全缺失,ERα30的开放阅读框预测了具有30kDa分子量的截短型蛋白质。与传统的全长型ERα66不同的是,ERα30缺乏配体结合域以及配体依赖的转录激活域(LBD/AF2),保留N端转录激活域(AF1),DNA结合域(DBD)和部分绞链区(Hinge),在其C端具有一段特殊的10个氨基酸序列的区域。我们运用RT-PCR的方法检测了33例原发性乳腺癌组织标本中ERα30 mRNA的表达,发现11个标本(33.3%)在mRNA水平上表达ERα30。ERa30表达与临床特征的相关性分析显示ERα30在ERa66、孕激素受体(PR)阴性乳腺癌中的表达高于ERα66、PR阳性乳腺癌,与年龄、绝经状态、淋巴结转移、肿瘤大小、临床分期、HER-2表达状态之间的关系不大。随后,我们构建了含ERα30的真核表达载体pEGFP-N1/ERα30,转染ERα30阴性的人乳腺癌细胞系MDA-MB-231,通过G418筛选获得ERα30过表达的人乳腺癌细胞系MDA-MB-231/ERα30。Western Blot检出截短型的30k Da蛋白质在稳转细胞系的表达,同时我们采用MTT检测细胞增殖能力、平板克隆形成试验测定细胞的克隆形成率、Transwell小室实验检测转移侵袭能力。研究结果表明,稳转细胞系MDA-MB-231/ERα30的相对增殖率、克隆形成率及转移侵袭能力均高于对照组。最后,我们构建ERα30-EGFP融合表达载体,发现ERα30-EGFP融合蛋白在MDA-MB-231细胞中的表达定位于细胞核中,实时荧光定量RT-PCR检测结果表明,ERα30上调EGFR和c-jun的表达,提示ERα30可能介导“非经典”的信号途径,例如配体非依赖性ERα30信号途径,即通过上调EGFR的表达激活生长因子信号传导途径和ERE非依赖性信号途径,即通过蛋白质-蛋白质相互作用稳定c-jun与DNA的结合而调节下游基因的转录,从而促进乳腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移。总之,我们发现并克隆了一种新的人雌激素受体α(hERα)剪接变体,ERα30;并对其功能和作用机制进行了初步研究。然而,仍有许多科学问题尚未解决,需要进一步的深入研究来明确ERα30在人类乳腺癌发生发展中的意义,为乳腺癌相关的复杂生物学问题提供更多新的解释。
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R737.9

【参考文献】

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1 陈鹏;马忠森;王秀丽;李博;任锦;胡娱新;郏博;刘锋;石莹;;人HMGN5基因shRNA慢病毒载体构建与RNAi效率的鉴定[J];中国实验诊断学;2011年01期

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本文编号：1297756