组织工程血管种子细胞和脱细胞支架的筛选及功能研究

发布时间：2017-12-17 02:23

  本文关键词：组织工程血管种子细胞和脱细胞支架的筛选及功能研究

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【摘要】：[目的]考虑到围产期间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)的生物学特性和细胞外基质(extracellular matrix,ECM)生物支架的优势,本研究探索脐带华通式胶间充质干细胞(Wharton's jelly mesenchymal stem cell,WJ-MSC)和羊膜间充质干细胞(amniotic membrane mesenchymal stem cell,AM-MSC)作为组织工程血管(tissue engineering blood vessel,TEBV)种子细胞的可行性,脱细胞制备猪颈动脉ECM支架并评估其理化特性。获得种子细胞和ECM支架,体外构建TEBV并植入体内,初步评估其功能。[方法]应用组织块贴壁法分离WJ-MSC和AM-MSC,从形态学、免疫表型和多向分化潜能等方面对其进行鉴定。基于MTT和成纤维细胞集落形成评估,分析WJ-MSC和AM-MSC的增殖能力和自我更新性能。通过血小板粘附评估、测定凝血酶原时间(prothrombin time,PT)和部分凝血酶活化时间(activated partial thromboplastin time,APTT)探索WJ-MSC和AM-MSC的血液相容性分析。基于细胞膜片技术,从组织学、电镜观察、生化分析、PCR和Live/Dead评估,比较WJ-MSC和AM-MSC在膜片形成过程中合成细胞外基质的性能和细胞活力,探索更适用于构建TEBV的MSC。获取新鲜猪颈动脉并随机分为5组(n=6),基于十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)、脱氧胆酸钠(sodium deoxycholate,SDC)和曲拉通 X-100(TritonX-100,Tri),分别应用 1%(m/v)SDS+1%(m/v)SDC(B组),0.5%(m/v)SDS+0.5%(m/v)SDC(C组),1%(m/v)SDS+1%(v/v)Tri(D组)和0.5%(m/v)SDS+0.5%(v/v)Tri)(E组)4种方案进行脱细胞处理,未脱细胞处理的猪颈动脉(A组),应用HE染色、五色套染、扫描电镜、免疫组化、DNA和细胞外基质定量等方法评价ECM支架,进一步测定生物力学性能(人大隐静脉做质控)。综合分析ECM支架,获得猪颈动脉ECM支架的最适制备方法,应用1%(SDS+SDC)的脱细胞方案制备猪颈动脉ECM支架,种植WJ-MSC构建TEBV,HE染色观察TEBV,建立兔腹主动脉间位移植模型,应用多普勒超声和HE染色初步评估TEBV的生理功能。[结果]基于外植体的方法,本研究成功分离获得成纤维细胞样的WJ-MSC和AM-MSC。与AM-MSC比较,WJ-MSC的增殖能力和自我更新能力更强,具备抗血小板粘附特性,血液相容性更好,此外,在体外培养构建细胞膜片的过程中,WJ-MSC合成胶原的能力更强,且细胞活性更佳。四种脱细胞方案中,B组和C组能完全去除细胞,而D组和E组于局部可见细胞残留,DNA定量分析结果显示,B组ECM支架内残存的DNA成分最少。脱细胞导致不定形细胞外基质成分破坏并去除部分异种抗原α-1,3-Gal,胶原纤维束和弹性蛋白保存完整,B组ECM支架的多孔结构在形态和尺寸方面优于其余组。脱细胞导致长轴最大应力、长轴Young's模量、爆破压力、缝线保持力和缝合保留强度下降,然而,对ECM支架的顺应性无明显影响。去除平滑肌细胞是导致猪颈动脉ECM支架生物力学性能改变的主要原因。应用1%(SDS+SDC)方案制备猪颈动脉ECM支架,种植WJ-MSC可构建TEBV,然而,HE染色显示细胞种植效率不高,TEBV体内植入后其生理功能有限。[结论]作为构建TEBV的种子细胞,WJ-MSC优于AM-MSC,WJ-MSC有望替代内皮细胞和成纤维细胞。应用1%(SDS+SDC)的脱细胞方法能获得更适合的猪颈动脉ECM支架。基于猪颈动脉ECM支架种植WJ-MSC,体外培养可获得具备一定生理功能的TEBV。
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R318.08;R654

【参考文献】

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1 蒲磊;吴剑;孟明耀;倪海燕;叶飞;李亚雄;蒋立虹;;不同脱细胞方案制备主动脉细胞外基质支架的比较研究[J];中国修复重建外科杂志;2014年11期

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本文编号：1298393