Tfh细胞调控B细胞分化及其对移植排斥反应作用的机制研究

发布时间：2017-12-17 21:27

  本文关键词：Tfh细胞调控B细胞分化及其对移植排斥反应作用的机制研究

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【摘要】：在我们人类赖以生存的外环境中,存在着大量对人类有害的微生物,如病毒、细菌、真菌、寄生虫及原生动物等,而当上述微生物入侵人体,这些外源生物性刺激将会引起机体免疫性应答。而机体的免疫系统能够识别外来入侵的关键是它可以识别这些微生物上的特异性标志——抗原。而器官移植,一项发展不过百年却又作为当今治疗脏器终末期疾病的主要方法之一,也会将移植物上的外来性抗原带入受者体内,而受者的免疫系统通过对这些外来性抗原的识别,会产生特异性的免疫应答,即移植排斥反应。经过数十年的研究,移植排斥反应被分为了两大种类,即细胞性排斥反应及体液性排斥反应。细胞性排斥反应常见于在急性排斥反应中,是机体在在移植物外来抗原的刺激下,T淋巴细胞识别抗原而大量激活、合并IL-2等促炎性细胞因子的生成增加,激活的T细胞大量增殖,引起了以T细胞为主的对移植物的排斥反应。当供体器官经移植手术植入受者体内,由于供体和受者之间的组织相容性抗原(MHC)的不同,受体外周循环中的T淋巴细胞识别移植物的抗原而获得第一信号激活,随后进入附近的外周免疫器官(脾脏或淋巴结)中,一部分转化形成淋巴母细胞,并迅速增殖分化为具有活性可识别抗原的致敏性T淋巴细胞。其中CD8+细胞毒性T淋巴细胞可以通过识别抗原引起细胞溶解直接对移植物造成损伤,而CD4+T辅助细胞则可以合成释放多种细胞因子(IL-2、IL-6、IFN-γ)等,通过具有直接杀伤作用的亚群直接或通过辅助CD8+T细胞、自然杀伤细胞和B淋巴细胞等间接作用于移植物造成损伤。而体液性排斥反应则是由B淋巴细胞介导(或DC识别抗原启动),首先B细胞经BCR(B cell receptor,BCR)特异性识别移植物表面抗原,激活第一信号;激活B细胞的第二信号即协同刺激信号则是由T辅助细胞与B细胞相互作用所提供的。激活的的B细胞随后进入生发中心,在T辅助细胞的协助下经过一系列分化过程形成浆细胞或记忆性B细胞,并通过浆细胞产生大量高亲和力抗体对移植物产生杀伤作用。传统免疫学的经典理论认为,针对TD抗原的抗体免疫应答是需要CD4+T细胞的辅助。CD4+T细胞在B细胞活化及体液免疫中发挥了十分重要的作用,传统理论认为,Th2细胞通过CD40/CD40L、CD28/B7与B细胞相互作用,并通过分泌IL-4、IL-2等来发挥辅助B细胞活化的作用。但B细胞活化后在外周免疫器官的生发中心中须经过体细胞突变、亲和力成熟、受体编辑和类型转换等过程,这些过程是否需要T细胞的辅助以及如何辅助或调控的机制尚没有研究透彻。通过近年的研究,滤泡辅助性T细胞(Follicular helper T cells,Tfh)亚群作为在生发中心内真正辅助B细胞分化的功能已得到了验证,而Tfh自身的分化过程也有了一定了解,但Tfh细胞辅助B细胞的机制并未完全揭示。目前研究显示,IL-21敲除小鼠出现Tfh细胞分化障碍,并影响了进一步的GC形成及抗体生成,因此,IL-21是Tfh细胞分化过程中的必须因子之一。针对Tfh分化过程中的此特点,我们希望通过以Tfh为靶点,通过阻断IL-21通路抑制体液性排斥反应,从而保护达到移植物的作用。一、Tfh细胞调控B细胞分化的机制在第一部分中,我们首先通过提取小鼠脾脏T细胞并应用IL-21对其进行刺激,通过蛋白印迹检测,IL-21可以明显活化T细胞内的STAT3通路,证明IL-21在小鼠脾脏内是通过活化T细胞内STAT3通路提供给T细胞向Tfh细胞分化的信号。进一步研究我们希望通过IL-21R-Fc阻断IL-21对T细胞的刺激作用,因此我们先用IL-21R-Fc对T细胞进行预处理,再进一步使用IL-21对其进行刺激,结果表明,在IL-21R-Fc浓度为10ng/ml时可完全阻断IL-21对T细胞内STAT3的激活。进一步研究我们通过小鼠体液性免疫(SRBC免疫)模型,研究使用IL-21R-Fc阻断IL-21信号通路后,对Tfh细胞分化的影响。在对不同处理的小鼠使用SRBC免疫后7天,首先对外周血中成熟B细胞的比例进行检测,结果无明显差异,证明IL-21-Fc并未对B细胞在骨髓中的分化产生影响;通过检测小鼠脾脏中Tfh细胞分化结果显示,IL-21R-Fc明显抑制了SRBC免疫后的Tfh细胞分化;通过对脾脏内生发中心的分析显示,Tfh细胞分化收到抑制后,生发中心的形成明显降低;对边缘区B细胞及滤泡B细胞的分析发现,滤泡B细胞的数量在IL-21R-Fc处理后大大减少,证明SRBC免疫后的反应为特异性体液免疫反应,且此反应收到了抑制;对外周血中的浆细胞及抗体量进行分析发现,IL-21R-Fc处理后浆细胞数量及抗体滴度都大大降低,直接证明了IL-21R-Fc对体液性免疫反应的抑制作用。二、Tfh细胞调控体液性排斥反应的作用及机制通过第一部分的实验,证明了IL-21R-Fc对Tfh细胞分化的抑制作用,因此,第二部分的实验我们使用IL-21R-Fc处理受体小鼠并进行心脏异位移植。在小鼠心脏移植后的急性排斥反应中,我们通过受体的血清浆细胞数量及抗体滴度的增加、移植物的Ig G及C4d沉积程度增加,证明小鼠心脏移植后的急性排斥反应有体液免疫的参加。而通过进一步实验使用IL-21R-Fc处理后的小鼠移植物生存期延长;移植物的心肌排列相对较好,心肌细胞水肿坏死减轻,炎症细胞浸润明显降低,血管内皮细胞肿胀程度较轻,炎症细胞浸润降低,证明其组织损伤降低;TUNEL结果IL-21R-Fc处理使心肌细胞的凋亡也有所降低;而通过体液性排斥反应诊断的金标准C4d的检测也明确表明IL-21R-Fc处理后的移植物内C4d的浸润明显降低;通过对受体外周血的检测,其血浆内浆细胞数量及抗体滴度也明显降低。所有的结果都证明,IL-21R-Fc对小鼠心脏移植后的体液排斥反应具有抑制作用。进一步我们对移植后受体的脾脏进行流式分析发现,IL-21R-Fc处理后小鼠移植后脾脏内Tfh细胞数量明显降低,生发中心的形成也受到了抑制。这与第一部分的结果相符合,证明了IL-21R-Fc在心脏移植中也可以移植Tfh细胞的分化。综上所述,我们首先通过IL-21刺激小鼠脾脏T细胞证明了其通过激活STAT3通路作用,而IL-21R-Fc可以阻断这种作用;利用小鼠体液免疫模型,我们证明了IL-21R-Fc可以通过阻断IL-21通路抑制Tfh的分化,进一步抑制了生发中心的形成,使B细胞分化成为浆细胞和记忆性B细胞的过程受到抑制,导致了抗体生成减少,从而减轻体液性免疫反应;进一步实验我们利用小鼠异位心脏移植急性排斥模型,证明体液免疫参与其中,而IL-21R-Fc可以通过抑制Tfh的分化进一步抑制抗体介导的排斥反应,为临床体液性排斥反应的治疗提供了新思路。
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R392.4

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