Th17和Treg细胞在肝硬化大鼠肠道细菌移位的作用研究

发布时间：2017-12-18 03:34

  本文关键词：Th17和Treg细胞在肝硬化大鼠肠道细菌移位的作用研究

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【摘要】：细菌移位(bacterial translocation,BT)是指细菌或者其产物从肠腔移位到肠系膜淋巴结(mesenteric lymph nodes,MLNs)或者其他的肠外器官。越来越多的证据表明,BT与肝硬化及其并发症的发展密切相关,如肝性脑病,肝肺综合征,肝肾综合征和肝衰竭。事实上,BT相关感染和自发性腹膜炎是肝硬化患者死亡的主要原因。虽然在肝硬化患者中,主要是有感染的肝硬化患者中,已观察到小肠细菌过度生长和肠道通透性增加与BT有关,但是对与BT密切相关的肠道免疫变化的了解很少。几种类型的肠道CD4+T细胞是防治BT的关键。Th17细胞主要存在于肠道固有层,尤其是小肠的固有层,是肠道粘膜免疫系统的重要组成部分,维持肠道粘膜免疫屏障的完整性密切相关,因此对于预防BT是非常关键的。Treg细胞在肠道固有层中聚集,维持肠道免疫系统稳态,因此影响BT的发生发展。因此,Th17和Treg细胞对维持肠道粘膜免疫系统的完整性起关键作用,与肠道细菌移位密切相关。本研究通过四氯化碳(carbontetrachloride,CC14)和苯巴比妥制造肝硬化腹水大鼠模型,研究肠道固有层、肝脏和血液淋巴细胞中Treg(CD3 + CD4 +CD25 + Foxp3 +),Th17(CD3 + CD4 + IL-17 +),和 Th1(CD3 + CD4 + IFN-γ +)细胞的变化,分析他们与BT的关系和相互作用机制。方法我们使用四氯化碳和苯巴比妥建立大鼠肝硬化腹水模型,使用临床自动分析仪测定大鼠血清中的肝功能水平,采用流式细胞仪技术检测肠道固有层、肝脏和血液淋巴细胞中Th17、Th1和Treg细胞比例,并运用酶联免疫吸附测定(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)方法测定了血清中脂多糖结合蛋白(lipopolysaccharide binding protein,LBP)的水平。同时为了进一步研究BT与肝硬化大鼠中Th17、Th1和Treg细胞变化之间的因果关系,我们仍然采用CC14建立大鼠肝硬化腹水模型,并使用诺氟沙星和万古霉素对大鼠进行肠道去污,分离大鼠外周血单核细胞、肝脏和肠道固有层淋巴细胞,流式细胞仪技术检测外周血单核细胞、肝脏和肠道固有层淋巴细胞中Th17、Th1和Treg细胞比例,并运用ELISA方法测定了血清中LBP的水平。结果为了确定是否肝硬化影响了 BT的发生,我们把分离到的MLNs进行培养,结果发现,正常对照组没有BT发生,CCl4诱导的肝硬化腹水大鼠BT的发生率是47.8%。与没有BT的肝硬化大鼠及正常大鼠相比,有BT的肝硬化大鼠血浆LBP的浓度更高,并且与MLNs分离培养到的菌落数成正相关(ρ = 0.918,P0.001);与没有BT的肝硬化大鼠相比,有BT的肝硬化大鼠具有更差的肝功能,更低的体重,更大的脾脏及更多的腹水量。并且,有BT的肝硬化大鼠血浆LBP的浓度与白蛋白浓度(ρ=-0.745;P0.01)及白蛋白/球蛋白成负相关(ρ=-0.769,P0.01),但是与 AST(ρ = 0.655,P0.05),TBil(ρ = 0.688,P0.05),和 DBil(ρ = 0.692,P0.05)成正相关;与体重成负相关(ρ=-0.893,P0.001),与脾脏的重量成正相关(ρ= 0.665,P0.05),及腹水量也成正相关(ρ = 0.878,P0.001)。有BT的肝硬化大鼠与没有BT的肝硬化大鼠相比,近端小肠中Treg细胞百分比明显增加(28.4±10.0vs.13.2±2.9,P0.001),Th17细胞及Th1细胞百分比均明显减少(14.9±2.8 vs.31.9 ± 9.0,P0.001;9.7 ±3.2 vs.21.8 ±3.7,P0.001);远端小肠中 Treg细胞百分比也明显增加(29.5±9.2vs.15.3±3.1,P0.001),Th17细胞及Th1细胞百分比也均明显减少(11.7 ±4.3 vs.24.1 ±6.2,P0.001;7.3 ±2.8 vs.19.7 ±4.7,P0.001);盲肠中只有Th17细胞百分比明显减少(10.7±2.9 vs.27.4 ±9.0,P0.001);结肠中 Treg 细胞百分比明显增加(21.2 ±4.7 vs.14.5 ± 1.9,P0.01),Th17细胞及Th1细胞百分比也均明显减少(3.6 ± 2.2 vs.8.3 ± 2.8,P0.001;5.0 ± 2.8 vs.18.1 ±6.1,P0.001);肝脏中Treg细胞及Th17细胞百分比明显增加(32.5 ±4.0 vs.19.2 ± 4.0,P0.001;14.4 ±3.3 vs.9.4 ±0.8,P0.01),Th1 细胞百分比明显减少(8.4±4.1 vs.13.3±3.0,P0.05);外周血单核细胞中Th17细胞及Th1细胞百分比也均明显减少(1.7±0.5 vs.3.2±0.4,P0.01;2.0±0.2 vs.4.0± 0.6,P0.001)。并且,我们研究了在有BT的肝硬化大鼠血浆中LBP的浓度与这些细胞变化之间的关系,与Tregs细胞在近端小肠(ρ = 0.691,P0.05)、远端小肠(ρ = 0.636,P0.01)和肝脏中的比例成正相关(ρ = 0.760,P0.05);与Th17细胞在近端小肠(ρ=-0.836,P0.01),远端小肠(ρ =-0.861,P0.01)及盲肠中(ρ =-0.675,P0.05)的比例成负相关;与Th1细胞在近端小肠(ρ =-0.809,P0.01),远端小肠(ρ =-0.802,P0.01)及肝脏中(ρ =-0.836,P0.05)的比例成负相关。总之,,Th17、Th1和Treg细胞在近端小肠和远端小肠中的百分比均与血浆中LBP的浓度具有明显相关性,说明这些细胞在肝硬化大鼠近端小肠和远端小肠固有层中的免疫变化与BT密切相关。为了进一步研究BT与肝硬化大鼠中Th17、Th1和Treg细胞变化之间的因果关系,我们使用诺氟沙星和万古霉素对大鼠进行肠道去污。结果发现,使用抗生素处理的肝硬化大鼠没有BT发生。与使用安慰剂处理的肝硬化大鼠相比,使用抗生素处理的肝硬化大鼠血清中LBP的浓度更低,血清中ALT,AST,TBi1和DBi1水平更低,大鼠的终体重更重,脾脏及腹水的量更小,Tregs细胞在近端小肠中的比例更低,Th17细胞在整个小肠、盲肠、结肠、肝脏和血液中的比例更高。而且这些细胞在使用抗生素处理的肝硬化大鼠组比例的变化与正常大鼠用及没用抗生素相比没有统计学意义,进一步说明了 BT引起了这些细胞在肝硬化中的变化。结论总之,BT可能增加了肝硬化大鼠近端小肠中的Tregs细胞,减少了肝硬化大鼠整个肠道固有层和血液中的Th17细胞;CC14诱导的肝硬化大鼠增加了 Tregs细胞在肝脏中的百分比,减少了 Th1细胞在盲肠和血液中的百分比;BT可能加剧了肝硬化大鼠整个小肠固有层和肝脏中Th1细胞的减少,Th17细胞在肝脏中的增加,及Tregs细胞在远端小肠和结肠中的升高。我们的数据暗示了肝硬化大鼠肠道固有层中Th17细胞的减少和Treg细胞的增加有助于BT的发生发展。免疫学的变化是器官特异性的,并且与BT相关。肝硬化导致了 BT,BT可能反过来加重的肝硬化的发展肝硬化和BT之间形成一个恶性循环。因此,了解肝-肠轴和其潜在的机制可以为肝硬化的治疗找到新的途径。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R575.2

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本文编号：1302670