益气养阴法中药防治非小细胞肺癌转移的系统评价及其分子机制研究

发布时间：2017-12-19 00:04

  本文关键词：益气养阴法中药防治非小细胞肺癌转移的系统评价及其分子机制研究

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【摘要】：研究背景肺癌是当今临床中最为常见的恶性肿瘤,且其发病率仍在逐年上升,国内外的致死率也是居高不下。在肺癌的分型中,非小细胞肺癌(NSCLC)约占肺癌总数的80%～85%,手术切除仍是目前NSCLC最有效且最好的方法,但仅仅只有20%NSCLC患者适宜手术治疗。目前按照最新的NCCN指南,NSCLC术后应予常规的辅助化疗,以铂类为基础的术后辅助化疗目前已成为早期和中期患者的主要治疗方法,诸多临床研究也已表明化疗能够起一定程度上到延长生存期、抑制瘤体生长的作用。但对于远期控制复发转移、延长无病生存期以及改善患者症状及生存质量方面,中医药的优势还是非常明显的。恶性肿瘤的病因病机复杂,气、血、痰、瘀、毒、虚等致病因素可以大致概括癌病的中医病机。对于大多数非小细胞肺癌病人来讲,一般发现便已是中晚期,病程迁延日久正气虚损,故气阴两虚的证候体现是最为明显的。因此益气养阴法中药治疗是对于NSCLC患者一个有效的治疗方案,而结合国际上公认的化疗方案进行中西医结合治疗是目前最为常用的方法,也取得了比较明显的疗效。在益气养阴法中药当中,肺瘤平膏作为临床及基础实验均研究较多的药物,其防治肺癌转移的效果已被广泛认可,但是对其分子机制的研究还不够深入。目前最新研究认为,肿瘤微环境可以改变肿瘤转移的潜能,因而从微观整体性方面来调控肿瘤微环境以防治肿瘤转移的方法越来越受到各方面重视。肿瘤微环境的两大核心是免疫与炎症,微环境内癌成分及非癌成分各自发挥着促进肿瘤转移及抑制肿瘤的转移的不同作用,而益气养阴法中药肺瘤平膏究竟在此系统内发挥着怎样的作用也是值得研究的。因此,本研究实验部分建立肿瘤免疫-炎性共培养模型,制备肺瘤平膏含药血清,观察其是否对微环境内癌成分(LL/2-luc-M38细胞)与非癌成分(DC、RAW264.7细胞)中的关键信号通路PI3K/AKT/NF-κB的表达起到不同的调节作用,从而达到防治肺癌转移的作用。研究目的1.旨在分析评价益气养阴法中药在非小细胞肺癌患者中的疗效和安全性及应用前景。2.选用益气养阴法的代表药物肺瘤平膏进行实验研究,探讨其对于肿瘤免疫-炎性微环境中的癌成分与非癌成分的调节作用,观察其是否对微环境内两种成分的关键信号通路PI3K/AKT/NF-κB的表达起到双向调节作用,从而探讨其预防肺癌转移的分子机制。研究方法1.本研究前半部分采用系统评价方法,对益气养阴中药疗法治疗NSCLC患者的疗效及安全性进行有效的评价。运用Cochrane协作网的系统评价方法进行汇总分析,查阅国内外知名的几大文献数据库,搜集益气养阴法治疗NSCLC的随机对照临床研究文献,运用Revman软件作定量合并分析(meta分析),并最终评价益气养阴法在治疗中晚期非小细胞肺癌中的地位及为其疗效和安全性提供依据。2.本研究实验部分选用了在临床中已广泛应用的益气养阴法代表中成药肺瘤平膏作为实验药物,进行体内体外实验。(1)通过体内实验利用流式细胞仪检测肺瘤平膏对Lewis肺癌荷瘤小鼠免疫功能的影响:首先对观察肺瘤平膏对Lewis肺癌荷瘤小鼠脾脏DC的调节作用,然后研究其对Lewis肺癌荷瘤小鼠脾脏TAM亚型的调节作用(2)建立小鼠髓系树突状细胞(DC)体外培养,并通过光镜、电镜进行形态学鉴定以及流式细胞仪检测其生物学特征。然后进行肺瘤平膏含药血清的制备,为体外实验做准备。(3)利用流式细胞仪研究肺瘤平膏含药血清对肿瘤免疫及炎性微环境中的非癌成分(DC及RAW264.7细胞)表型的影响:包括肺瘤平膏含药血清对C57BL/6小鼠髓系DC表型的影响及肺瘤平膏含药血清对RAW264.7细胞数量及表型的影响。(4)通过Western blot与实时定量荧光PCR方法,研究肺瘤平膏含药血清对肿瘤免疫及炎性微环境中癌成分与非癌成分PI3K/AKT/NF-κB表达的影响:首先建立肿瘤免疫共培养微环境,观察肺瘤平膏含药血清对免疫共培养微环境中LL/2-luc-M38细胞与髓系DC中PI3K/AKT/NF-κB表达的影响;其次建立肿瘤炎性共培养微环境,观察肺瘤平膏含药血清对炎性共培养微环境中LL/2-luc-M38细胞与RAW264.7细胞中PI3K/AKT/NF-κB表达的影响。最终研究肺瘤平膏含药血清是否对肿瘤细胞(癌成分)与DC、RAW264.7细胞(非癌成分)中的关键信号通路PI3K/AKT/NF-κB起着双向调节作用。研究结果1.从系统评价的最终结果来分析,益气养阴法中药联合化疗治疗非小细胞肺癌对比单独应用化疗,在近期有效率的提升、生存质量的改善、骨髓毒性反应的降低及中医症候的改善方面均有明显效果,其差异均具有统计学意义。2.肺瘤平膏含药血清对肿瘤免疫及炎性微环境中非癌成分的影响:肺瘤平膏对Lewis肺癌荷瘤小鼠脾脏DC及脾脏TAM亚型的调节作用:脾脏DC在单纯荷瘤的小鼠中(Model组)数量由4.26%逐渐降低到2.59%,FLP组(肺瘤平膏灌胃)小鼠的DC数量在14d、21d、28d,分别为5.39%、4.83%、4.15%。相对于DC的低数量而言,M1、M2巨噬细胞及其比值在上述两组中均相对较高。M1型巨噬细胞(Model组)数量由8.59%逐渐上升到25.98%,同时M2型数量由0.92%逐渐上升到5.42%,M1/M2由9.34下降至4.79;对于FLP组荷瘤小鼠,在21d时,两型巨噬细胞数量分别为23.16%及2.77%,数值较高,而M1/M2比值分别在3个日期时则分别为7.86、8.36、9.62。3.肺瘤平膏含药血清对C57BL/6小鼠髓系DC表型的影响:观察流式细胞仪显示DC所表达的CD11c、MHCII类分子中,CD11c/MHC-II为70.59%、CD11c/CD80为66.01%(肺瘤平膏组),其与空白组相比较有统计学差异(P0.01);肺瘤平膏含药血清对RAW264.7巨噬细胞数量及表型的影响:RAW264.7细胞在经过IL-4处理后通过流式细胞仪观察:肺瘤平膏血清组M1/M2的比例较空白组明显升高(5.25),F4/80-CD16/32及F4/80-CD206的比例分别为12.14%、2.31%,与空白组相比下降程度有统计学意义(P0.05)。4.肺瘤平膏含药血清在免疫共培养微环境中的对于癌成分与非癌成分中的PI3K/AKT/NF-κB表达的不同影响:运用Western blot及实时定量荧光PCR方法检测:LL/2-luc-M38在肿瘤-免疫共培养环境中,PI3K、AKT、NF-κB的蛋白与基因的表达被肺瘤平膏含药血清组(FLP-S)所抑制,而其对于NF-κB的抑制最为明显;DC细胞在肿瘤-免疫共培养环境中,其PI3K、AKT、NF-κB的蛋白与基因的表达能够被FLP-S促进,而其对于PI3K表达最为明显。肺瘤平膏含药血清在炎性共培养微环境中癌成分与非癌成分中的PI3K/AKT/NF-κB表达的不同影响:LL/2-luc-M38在肿瘤-炎性共培养环境中,PI3K、AKT、NF-κB的蛋白及mRNA基因的表达均能够被肺瘤平膏含药血清(FLP-S)所抑制,而其对于PI3K、NF-κB的抑制最为明显;RAW264.7细胞在此共培养环境中,PI3K、AKT、NF-κB的mRNA基因表达及AKT、NF-κB蛋白表达均被均FLP-S所促进,以NF-κB的基因提升最为明显(P0.01),仅有PI3K的蛋白表达较前降低。研究结论1.益气养阴法中药对于非小细胞肺癌的治疗作用还是值得肯定的,其联合化疗的治疗方案在生存期、毒副反应、生存质量、中医症候改善等方面均较单独化疗有明显的优势。因此,今后无论从安全性或是疗效方面来看,益气养阴法中药是值得继续在临床中推广应用的。2.肺瘤平膏对于肿瘤微环境中非癌成分的影响主要在于对树突状细胞及巨噬细胞的数量的调节作用,使荷瘤小鼠的免疫系统处于平衡稳定的状态。3.肺瘤平膏含药血清可以提高髓系DC的数量,并且可以促进髓系DC的发育。从肺瘤平膏含药血清对RAW264.7细胞的活化方向来看,其并不是仅抑制M2型巨噬细胞,而且对M1型巨噬细胞也有抑制作用,其在调节M1、M2的同时,以抑制M2型巨噬细胞为优势明显。4.肺瘤平膏含药血清对肿瘤微环境中的癌成分与非癌成分中起平衡调节作用的关键信号通路PI3K/AKT/NF-κB的表达具有不同的双向调节作用,其中NF-κB分子在肺瘤平膏含药血清对于肿瘤-炎性共培养环境中的调节作用中占主导地位。其对于微环境中的肿瘤细胞成分及非癌成分中具有促进功能的成分均具有抑制其发展转移的作用,而对于非癌成分部分则总体上具有促进作用。因此从整体实验结果来讲,肺瘤平膏含药血清对微环境的调控,可能最主要是具有平衡癌成分与非癌成分的作用。
【学位授予单位】：中国中医科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R273

【参考文献】

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本文编号：1306109