幽门螺杆菌感染相关非编码RNAs筛选鉴定与功能研究

发布时间：2017-12-19 00:30

  本文关键词：幽门螺杆菌感染相关非编码RNAs筛选鉴定与功能研究

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【摘要】：目的:幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)为人胃部疾病的重要致病菌之一,世界范围内感染率达到60%。幽门螺杆菌的致病机理非常复杂,目前主要认为是幽门螺杆菌毒力因子及宿主免疫应答所介导的胃黏膜持续性损伤,其中的具体分子调控机制尚不清楚。近年来研究表明,非编码RNAs(non-coding RNAs,ncRNAs),主要是微小RNAs(microRNAs,mi RNAs)和长链非编码RNAs(long non-coding RNAs,lncRNAs),它们作为调控性分子在众多生物学过程及疾病和肿瘤的发生发展中发挥重要的作用。但目前参与幽门螺杆菌感染致病的非编码RNAs尚未完全发现且功能不明,本研究以生物信息学、分子生物学、细胞生物学、免疫学等技术筛选、鉴定幽门螺杆菌感染相关非编码RNAs,并以其中的hsa-mir-29a-3p为研究对象,探讨其功能,为研究非编码RNAs在幽门螺杆菌感染的致病机制中的调控作用奠定基础。方法:1、幽门螺杆菌26695菌株与胃黏膜GES-1细胞以MOI=100:1共培养,以炎症指标IL-8、COX-2的升高验证感染模型的成立。2、基因芯片检测幽门螺杆菌感染组和非感染对照组胃黏膜GES-1细胞编码和非编码基因的表达谱,并用系统聚类分析差异表达的编码和非编码基因。3、根据差异表达基因的芯片信号强度基于皮尔逊相关系数法构建非编码基因和编码基因的共表达网络;运用Gene Ontology和KEGG Pathway富集分析差异共表达的编码基因。4、用实时荧光定量PCR技术鉴定芯片结果,初步筛选差异表达的非编码RNAs;并在不同菌株、不同胃黏膜细胞的感染模型中鉴定非编码RNAs的表达。5、收集临床胃黏膜标本;在临床胃黏膜标本中鉴定非编码RNAs表达;并运用ANOVA-post hoc分析差异表达非编码RNAs与幽门螺杆菌感染相关胃黏膜病理改变之间的相关性。6、以差异表达hsa-mir-29a-3p为研究对象,qrt-pcr检测不同感染模型及临床标本中hsa-mir-29a-3p的表达情况。7、转染hsa-mir-29a-3p的模拟物/抑制剂,提取细胞总蛋白,westernblot检测信号转导、炎症、肿瘤形成等相关指标的表达。8、利用生物信息学平台预测hsa-mir-29a-3p潜在靶基因;构建靶基因3’utr靶位点和突变体双荧光素酶报告载体,与hsa-mir-29a-3p模拟物/抑制剂共转染hek-293细胞,检测荧光强度的变化,确定靶基因。9、用westernblot验证hsa-mir-29a-3p对靶基因蛋白表达的调控以及在幽门螺杆菌感染中hsa-mir-29a-3p对靶基因蛋白表达的调控,确认hsa-mir-29a-3p-靶基因的表达网络受幽门螺杆菌感染的调控。10、用westernblot验证hsa-mir-29a-3p靶基因在不同感染模型中的表达;qrt-pcr及免疫组化实验检测临床标本中hsa-mir-29a-3p靶基因的表达情况,分析hsa-mir-29a靶基因表达是否与hsa-mir-29a-3p的表达呈负相关。11、过表达或敲减胃黏膜细胞中hsa-mir-29a-3p靶基因的表达,westernblot、免疫荧光、elisa等技术检测靶基因对nf-κb通路的调控作用以及在幽门螺杆菌感染中hsa-mir-29a-3p靶基因对nf-κb通路的调控影响。结果:1、在成功构建体外感染模型基础上,芯片分析幽门螺杆菌感染的胃黏膜ges-1细胞中基因表达谱的变化,共筛选出565个差异基因和347个差异非编码rnas(foldchange≥2或≤0.5,p0.05)。2、构建了差异编码基因-非编码基因的共表达网络,go和keggpathway富集分析表明差异基因在细胞增殖与分化、转移、凋亡、免疫应答及基因转录等生物学行注释中以及相关信号通路中富集。3、从细胞模型和临床标本中筛选获得了幽门螺杆菌感染相关的四条差异表达长链非编码rnas(n345630、xloc_004787、n378726和linc00473)和三条差异表达微小rnas(hsa-mir-4500、hsa-mir-29a、hsa-mir-221)。4、xloc_004787、linc00473与幽门螺杆菌感染的慢性炎症、肠化生密切相关,hsa-mir-29a、hsa-mir-221与幽门螺杆菌感染的慢性炎症密切相关,hsa-mir-221与幽门螺杆菌感染的胃癌有相关性。5、预测并鉴定了hsa-mir-29a-3p在胃黏膜细胞中的靶基因为A20,hsa-mir-29a-3p能直接介导靶基因A20蛋白的表达抑制;幽门螺杆菌的感染诱导hsa-mir-29a-3p上调进而调控A20蛋白的表达。6、靶基因A20在胃黏膜细胞中参与了NF-κB通路的调控;hsa-mir-29a-3p通过调控靶基因A20的表达,在胃黏膜细胞中间接参与了幽门螺杆菌感染诱导的相关炎症反应。结论:1、利用高通量基因芯片技术分析筛选获得了幽门螺杆菌感染相关的非编码RNAs和编码基因的差异表达谱。我们认为分析幽门螺杆菌感染相关的非编码RNAs的表达有助于从非编码调控分子的角度更好了解幽门螺杆菌感染致病的机制。2、建立了幽门螺杆菌感染相关的差异编码基因-非编码基因的共表达网络,进一步对非编码RNAs共表达的差异编码基因进行GO和KEGG Pathway富集分析,为推断幽门螺杆菌感染相关非编码RNAs的生物学功能及潜在参与调控的信号通路奠定相关理论基础。3、筛选获得了差异表达的非编码RNAs,与幽门螺杆菌感染相关胃黏膜疾病密切相关。4、Hsa-mir-29a-3p高表达与幽门螺杆菌的感染相关;hsa-mir-29a-3p在胃黏膜细胞中的靶基因是A20;hsa-mir-29a-3p通过调控靶基因A20的表达,在胃黏膜细胞中可能参与了幽门螺杆菌感染诱导的相关炎症反应的负向调控。
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R573

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本文编号：1306238