双区段检测提高乙型肝炎病毒核酸检测性能的研究
本文关键词：双区段检测提高乙型肝炎病毒核酸检测性能的研究 出处：《北京协和医学院》2017年博士论文 论文类型：学位论文
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【摘要】：乙型肝炎病毒(HepatitisB virus,HBV)是一种严重危害人类健康的DNA病毒。HBV DNA定量检测在乙肝治疗过程中发挥重要作用,是抗病毒治疗效果监测重要指标。目前用于HBVDNA定量试剂多采用的是单引物/探针的设计方法,但是HBV病毒具有较高的突变率和耐药突变,如果标本引物/探针结合区发生错配,可导致HBVDNA定量值低于实际值,甚至出现假阴性。本文基于HBVDNA基因组保守区,设计了一种新的双引物/双探针的策略,建立了一种双重荧光HBVDNA定量PCR方法。方法包括引物探针的设计与筛选、体系的建立和优化。并对建立的检测体系进行了方法学评价,包括线性范围、最低检出限(the limit of detection,LOD),特异性等。为验证其临床实用性,我们将新的定量方法的定量值分别与商品化试剂COBAS TaqManHBVTest,version2以及达安定量试剂进行比较和一致性分析。对其中定量值差别10倍以上的标本,进行测序和质粒验证。结果显示:本研究建立的双引物/双探针的HBVDNA定量方法具有良好的检测性能。与商品化COBAS TaqMan HBV Test version 2以及达安定量试剂定量值具有良好的一致性。两种试剂均存在与本研究建立方法定量值差10倍以上标本,测序结果发现在COBAS TaqMan HBV Test version 2试剂反向引物nt1962和1963位置存在突变位点。用包含这些突变序列的质粒进行定量验证,COBAS TaqManHBVTest version 2试剂对质粒定量值存在偏低的情况。方法中S区和C区定量值具有良好的一致性(R2=0.9657),但有5例样本存在C区定量值低于S区10倍以上的情况,测序结果发现这部分标本在引物结合区存在突变。本研究建立的双引物/双探针的HBVDNA定量方法,可降低因单引物/单探针与标本序列错配导致定量值偏低的风险,为临床对HBV的诊断、治疗、预后提供准确依据。HBV核酸检测是血液核酸筛查(nucleotide acid test,NAT)重要组成部分,在防止HBV经输血传播,保障输血安全中发挥重要作用。HBV是高度变异的病毒,单区段的HBV核酸筛查可能存在漏检风险,威胁输血安全。本研究中,建立了一套基于HBV保守的S和C区的HBV核酸检测方法。对其进行了最低检出限和特异性等方法学评价。用自建方法对两种血筛试剂:浩源和Cobas TaqScreen MPX Test,version 2检测阴阳性不一致的标本进行检测,并对标本进行HBV DNA定量检测。结果显示:自建方法具有良好的方法学检测性能。浩源和Cobas TaqScreen MPX Test,version 2血筛试剂检测不一致标本中,8例标本HBV DNA定量浓度高于其LOD发生漏检,间接证明HBV核酸血液筛查中,单区段检测存在漏检风险,双区段检测可有助于降低漏检风险,保障输血安全。
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R512.62;R440
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，本文编号：1322261
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