木香烯内酯和去氢木香内酯抑制胶质瘤相关作用机制的研究

发布时间：2017-12-23 07:42

本文关键词：木香烯内酯和去氢木香内酯抑制胶质瘤相关作用机制的研究　出处：《大连医科大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的:两种倍半萜烯内酯,木香烯内酯(Costunolide,CT)和去氢木香内酯(Dehydrocostus lactone,DHE),在过去被用作为抗炎药来治疗多种疾病。最近几年,因研究发现他们对多种恶性肿瘤均表现出良好的抗癌效果而引起广泛关注。然而,它们能否对胶质瘤产生作用及相关作用机制目前却知之甚少。本课题旨在探讨二者抗胶质瘤的作用,以及潜在的作用机制。方法:为了评估CT和DHE抗胶质瘤的作用效果,我们用不同浓度的CT和DHE(0,1,10,25,50和100μM)对三种胶质母细胞瘤细胞系(U118,U251和U87)分别处理12,24,36和48小时。然后采用MTT实验去检测细胞活力。接下来,我们应用克隆形成实验去检验CT和DHE对U87和U251细胞克隆形成能力的影响。随后,我们在无血清的情况下进行划痕实验,来检验CT和DHE对胶质母细胞瘤细胞系迁移能力的影响。激光共聚焦免疫荧光实验被用来检测经DHE处理的U87细胞,是否会造成细胞色素C从线粒体释放到胞浆中。然后,我们应用western blot的方法进一步检测在DHE处理U87细胞的过程中,从线粒体释放到胞浆中的细胞色素C的量。为了更好的探讨DHE诱导U87细胞凋亡的分子机制,我们通过western blot的方法对线粒体介导的凋亡信号通路中的几个凋亡相关蛋白予以检测。后来,我们应用western blot实验方法,对三种人源胶质母细胞瘤细胞系(U118,U251和U87)中的COX-2蛋白表达情况予以检测,来比较三者之间的相对表达量的高低。之后,我们以U87和U251细胞系为实验细胞,检测DHE抑制胶质母细胞瘤生长的作用是否与COX-2相关。然后,分别用western blot和RT-PCR的方法在蛋白和m RNA水平对COX-2的表达予以检测。为了明确DHE对胶质母细胞瘤U87细胞的COX-2 m RNA的表达水平的抑制效应是否是通过影响p300和p65/p50NF-κB与COX-2启动子的结合实现的,我们将经DHE(未)处理过的U87细胞通过染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation assay,Ch IP)实验予以检测分析。为了进一步明确DHE是否影响p300和p65/p50 NF-κB与COX-2启动子的结合活性,我们采用链霉亲和素-琼脂糖pull down实验对其予以检测。该实验的大致情况是,向经DHE(未)处理过的U87细胞的核蛋白提取液中加入生物素化的COX-2启动子区探针和链霉亲和素-琼脂糖小球。孵育后离心,然后,与COX-2结合的p300和p65/p50 NF-κB以复合体的形式被沉淀下来,随后执行western blot实验予以分析。其后,我们对经DHE(未)处理过的U87细胞核蛋白提取液中总的p300和p65/p50 NF-κB的蛋白量予以检测分析。为了进一步证实DHE抑制p300的募集和p65/p50 NF-κB蛋白的核转位和它们之间的相互作用,我们采用免疫荧光染色,检测p300和p65/p50 NF-κB在U87细胞中的定位和分布。为了充分明确DHE对胶质母细胞瘤作用的相关分子机制,我们接下来调查DHE对U87和U251细胞中IKKβ/IκBα/NF-κB信号通路的影响,采用western blot方法对p-IKKα/β、IKKα、IKKβ、p-IκBα、IκBα、p-p65和p65蛋白的表达水平予以检测。此后,我们设想IKKβ可能是DHE作用于胶质瘤细胞的一个靶点。为了验证这一假设,我们应用分子对接实验来模拟DHE和IKKβ之间的相互作用。为了检测DHE是否可以通过血脑屏障,我们给每只Sprague Dawley(SD)大鼠以100 mg/kg的剂量注射DHE。一小时后,我们采用立体定位的方式从大鼠的小脑延髓池抽取脑脊液(Cerebro-Spinal Fluid,CSF)。然后,利用乙腈对CSF中的DHE进行萃取,随后用质谱进行分析。然后,我们建立裸鼠种植瘤模型来进一步检验DHE在体内抑制胶质瘤的作用情况。为了监测DHE的毒性,每两天记录裸鼠体重;为了监测DHE的抑瘤效果,每隔一天记录肿瘤的大小。所有裸鼠在种瘤30天后处死,随后将肿瘤完整取出称重,然后放入10%福尔马林中固定。此外,为了进一步探索DHE在体内抑制肿瘤生长的潜在作用机制,我们应用免疫组化实验对种植瘤中COX-2、p-p65和p-IKKβ的水平予以检测。结果:将三种胶质母细胞瘤(U118、U251和U87)细胞系用不同浓度的CT和DHE处理不同时间后,应用MTT实验对细胞活力予以检测。我们发现CT和DHE都可以抑制肿瘤细胞的生长,且呈剂量和时间的依赖性。经CT处理48小时后,CT对U118、U251和U87三种细胞作用的IC50值分别是25.24±1.15、34.45±2.8和40.18±3.21μM;而DHE对U118、U251和U87三种细胞作用的IC50值分别是17.16±2.11、22.33±1.93和26.42±2.84μM。然后,应用克隆形成实验对细胞克隆形成能力予以评估。我们发现与对照组相比,CT和DHE均可以显著抑制克隆形成的数量,并呈现剂量依赖性。再应用划痕实验对细胞的迁移能力予以评估。我们发现与对照组相比,CT和DHE可以显著抑制肿瘤细胞的迁移率。此后,应用激光共聚焦免疫荧光实验检测DHE是否可以引起U87细胞中的细胞色素C从线粒体中释放。在对照组,细胞色素C主要存在于线粒体中,然而,随着DHE浓度的增加,绿色荧光开始弥散,表明胞浆中细胞色素C水平逐渐升高。然后,我们对线粒体凋亡通路的相关蛋白予以检测,发现DHE可以显著增加胞浆中细胞色素C的蛋白水平,以及cleaved caspase3/9蛋白的水平,并且下调Bcl-2蛋白的水平和Bcl-2/BAX的比率。然后,我们应用western blot方法对U118、U251和U87细胞中的COX-2蛋白表达水平予以检测,结果表明,U87和U251细胞中COX-2蛋白表达量明显高于U118细胞。因此,我们选用U87和U251两种细胞系去验证DHE对胶质瘤细胞生长的抑制效应是否与影响COX-2的表达相关。Western blot和RT-PCR的结果表明在蛋白和m RNA水平DHE都可以有效的抑制COX-2的表达,并呈现剂量依赖性。接下来,我们通过Ch IP实验和链霉亲和素-琼脂糖pull down实验来验证,是否p300和p65/p50 NF-κB参与了DHE对COX-2的调节过程。结果表明,与对照组相比,DHE可以显著抑制p300的募集和p65/p50 NF-κB与COX-2启动子的结合。随后,western blot结果表明,与对照组相比,经DHE处理后,胞核中p300和p65/p50 NF-κB的蛋白量显著减少。然后,我们通过激光共聚焦免疫荧光染色来观察U87细胞中p300和p65/p50 NF-κB的定位和分布情况。结果表明,与对照组相比,经DHE处理后,p300和p65/p50 NF-κB在胞核中的量明显减少,而在胞浆中的量相对增多。因此,为了充分明确DHE对胶质母细胞瘤作用的相关分子机制,我们接下来检测DHE对U87和U251细胞中IKKβ/IκBα/NF-κB信号通路的影响。Western blot结果表明,与对照组相比,经DHE处理后,p-IKKα/β、p-IκBα和p-p65蛋白的水平显著下调,且呈剂量依赖性。然而,IKKα、IKKβ、IκBα和NF-κB p65的蛋白表达水平基本不变。这说明DHE可能是通过抑制IKKβ的活性而抑制NF-κB的激活。然后,行分子对接实验表明,DHE可以与IKKβ的ATP结合位点相互结合。这些结果表明,DHE是通过作用于IKKβ靶点来抑制NF-κB信号通路,从而抑制COX-2的表达的。在体内研究中,将CSF样本通过质谱检测分析发现,在1.81 mins出现一个单峰。表明在大鼠模型中,DHE可以迅速通过血脑屏障。因此,我们建立裸鼠种植瘤模型进一步探讨DHE在体内抑制胶质母细胞瘤生长的作用。在DHE处理过程中,裸鼠体重未发生明显变化,然而,与对照组相比,处理组的肿瘤体积和重量均明显减小。所以,这些结果表明,DHE在体内模型中也能够很好的发挥抗胶质瘤作用。接下来,免疫组化结果表明DHE可以抑制IKKβ/NF-κB/COX-2通路的激活,这可能是DHE抑制种植瘤生长的机制之一。结论:本研究旨在探讨CT和DHE抗胶质瘤的特性及其潜在的作用机制。研究表明CT和DHE均可以显著抑制胶质母细胞瘤的细胞活力、增殖能力和迁移能力。同时,DHE还可以通过促进细胞色素C的释放,激活caspase信号级联,从而诱导线粒体介导的细胞凋亡。此外,本研究证实DHE可以通过靶向IKKβ激酶的ATP结合位点,抑制NF-κB信号通路的激活,从而抑制p300和NF-κB对COX-2基因转录的调节。另外,本研究首次证实DHE可以通过血脑屏障。而且,体内实验表明,DHE可以抑制裸鼠种植瘤的生长,并且这种效应可能部分是通过抑制IKKβ/NF-κB/COX-2通路的激活实现的。
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R739.41

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