多酸基荧光生物探针的制备及其在单增李斯特菌免疫检测中的应用

发布时间：2017-12-24 08:44

本文关键词：多酸基荧光生物探针的制备及其在单增李斯特菌免疫检测中的应用　出处：《吉林大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：近年来,全球食品安全恶性事件频发,食品安全已经成为世界各国共同关注的公共卫生问题之一,它不仅威胁到消费者的身体健康和生命安全,也严重影响了经济的发展。据世界卫生组织(WHO)报道,由病原微生物引起的食源性疾病是影响食品安全最主要的因素之一。因此建立和完善食源性疾病及其致病菌的监测体系,预防和控制食源性疾病传播已引起世界各国卫生部门和食品安全部门的高度重视。单核细胞增生性李斯特菌(Listeria Monocytogenes,LM)是一种重要的食源性人兽共患传染性病原菌,它广泛存在于肉类、蛋类、禽类、海产品、乳制品、蔬菜及冷藏食品中等,由其引起的感染疾病可导致人和动物的脑炎、脑膜炎、败血症以及孕妇的流产早产、流产、及死胎,且病死率较高,给畜牧业以及人类生命健康安全造成了严重威胁,已被WHO列为食源性病原菌主要监测菌之一。因此,建立快速、准确的食品中LM病原菌的检测技术,对于食品安全的防控、保障居民的健康、促进社会稳定等具有重要意义。本课题研究主要是在前期研究工作的基础上,设计合成了一种新型的功能化多酸基荧光微球,将其与LM单克隆抗体进行偶联制备荧光生物探针,利用“双抗体夹心”免疫原理,借助流式细胞检测技术平台,建立一种快速、准确、灵敏且特异的LM检测方法。课题研究主要分为三个部分:第一部分LM多克隆抗体与单克隆抗体的制备及鉴定(1)多克隆抗体的制备及鉴定以LM全菌作为抗原,制备弗式完全佐剂和弗式不完全佐剂疫苗,采用皮下多点注射法免疫新西兰白兔,收集抗血清,用辛酸-饱和硫酸铵法对血清中的抗体进行粗提,Protein G亲和层析法进一步纯化,BCA蛋白定量试剂盒测定抗体蛋白含量,优化的间接ELISA方法检测抗体的效价和特异性,SDS-PAGE凝胶电泳检测抗体的纯度,选用生物素标记试剂盒对上述纯化的兔LM多克隆抗体Ig G进行生物素标记。结果显示,经Hi Trap Protein G HP纯化后的LM多克隆抗体Ig G纯度较高,可明显观察到两条目的条带,蛋白含量为10.65 mg·L-1,效价可达到1:25600,特异性较好,且每摩尔Ig G抗体标记的生物素摩尔数为3.63。(2)单克隆抗体的制备及鉴定应用杂交瘤细胞技术,以LM全菌作为抗原免疫BALB/c小鼠。免疫后分离免疫小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合。用优化的间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞,采用有限稀释法筛选亚克隆,筛选出能稳定分泌LM抗体的阳性杂交瘤细胞,经扩大培养后,制备小鼠单抗腹水。采用间接ELISA测定腹水中的单抗效价和特异性,单抗亚型鉴定试剂盒鉴定得到的抗体亚型,硫酸铵沉淀法结合Hi Trap IgM HP亲和层析法进行纯化,SDS-PAGE凝胶电泳试验测定纯度,BCA蛋白定量试剂盒测定抗体蛋白含量。结果显示,经过亚克隆筛选出1株能稳定分泌LM单克隆抗体的杂交瘤细胞株5-B3,腹水中抗体效价大于1:12800,抗体亚型为Ig M型,纯化后所获得的抗体纯度较高,浓缩后的抗体蛋白含量为1.75 mg·L-1,且特异性较好。第二部分功能化多酸基荧光微球及其LM生物探针的制备(1)功能化多酸基荧光生物微球的制备及表征采用层接层静电自组装技术,选用聚电解质PEI和PAA对表面含有羧基带负电荷的聚苯乙烯微球进行表面改性,然后将所制备的带负电荷的多酸荧光染料[N(C_4H_9)_4]_2[V_6O_(13){(OCH_2)_3CNH-CH_2-C_(16)H_9}_2](简称POMs-FD)包覆在微球表面,然后通过聚电解质PEI和PAA进一步修饰,最终使微球表面带有羧基官能团。利用Zeta电位分析仪、荧光光谱仪、激光共聚焦显微镜和流式细胞仪对所制备的荧光微球进行表征,结果显示多酸荧光染料POMs-FD可成功包覆到聚苯乙烯微球上,所制备的功能化多酸基荧光微球(POMs-FD@PS)具有良好的荧光发光特性,且稳定性较好。(2)多酸基荧光生物探针的制备及表征利用EDC/NHS活化所制备的表面含有-COOH的POMs-FD@PS荧光微球,并与所制备的LM单克隆抗体进行偶联,优化LM单克隆抗体标记量,制备可识别LM的多酸基荧光生物探针,通过流式细胞仪检测技术平台,将制备的多酸基荧光生物探针初步用于LM菌抗原的检测。结果显示,微球最佳蛋白偶联量为105个微球:56μg蛋白,成功制备了识别LM的多酸基荧光生物探针,经验证该探针可用于LM流式微球-液相芯片检测。第三部分LM流式微球-液相芯片检测方法的建立与评价(1)LM流式微球-液相芯片检测方法的建立将所制备的多酸基荧光生物探针,依据“双抗体夹心”荧光免疫分析原理,利用流式细胞检测技术平台,通过优化反应条件,建立一种LM流式微球-液相芯片检测方法。结果显示,本课题所建立的LM流式微球-液相芯片检测方法的最佳反应条件为:单抗最佳偶联浓度为28μg·mL~(-1),生物素标记的多克隆抗体工作浓度为250μg·mL~(-1),SA-PE的工作浓度为15μg·mL~(-1)。(2)LM流式微球-液相芯片检测方法的评价对所建立的LM流式微球-液相芯片检测方法的检出限、特异性和重复性进行评价,同时与利用商品化的荧光微球所建立LM Luminex-液相芯片检测方法和分离培养鉴定法进行比较,评价该方法的检测效果。结果显示,LM流式微球-液相芯片检测法的最低检出限为1.0×106 CFU·mL~(-1),且特异性和重复性较好。所建立LM Luminex-液相芯片检测方法最佳反应条件为:单抗最佳偶联浓度为15μg·mL~(-1),生物素标记的多克隆抗体工作浓度为250μg·mL~(-1),SA-PE的工作浓度为8μg·mL~(-1);将LM Luminex-液相芯片检测方法与流式微球-液相芯片法进行比较,流式微球-液相芯片法的检出限更低,稳定性更好。将LM流式微球-液相芯片检测法与分离培养鉴定法进行比较,48份实验室模拟样本,经过24 h增菌培养后,利用已建立的流式微球-液相芯片法和传统分离培养法分别检测,两种方法的最低检测限均可达到6 CFU·g-1,结果符合率为100%,表明所建立的流式微球-液相芯片方法具有较好的准确性,但LM流式微球-液相芯片方法可节省时间,且检测工作无需带菌操作,安全性更高。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R155.3

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