血管紧张素Ⅱ对多巴胺能神经元凋亡的影响及机制研究

发布时间：2017-12-24 12:31

本文关键词：血管紧张素Ⅱ对多巴胺能神经元凋亡的影响及机制研究　出处：《南京医科大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：随着全球人口老龄化进程的加剧,帕金森病(Parkinson's disease,PD)深深影响着全球范围内老年人的生活质量,同时也造成了巨大的社会经济负担。PD最主要的临床表现是运动迟缓、静止性震颤、肌强直和姿势平衡障碍,主要的病理学特点是黑质区多巴胺能神经元的进行性缺失。目前其发病机制尚不明确,且缺乏有效的防治手段阻止疾病的进程。近来越来越多的研究发现,PD患者及PD动物模型的脑中,肾素-血管紧张素系统(Renin-angiotensin-system,RAS)的主要组成部分血管紧张素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)的含量明显增高,提示PD的发病机制与脑内RAS的过度激活密切相关。因此,从生物学层面研究AngⅡ与PD病理进程的关联,成为了本领域的一个研究热点。RAS主要负责调节机体的血压和水、盐平衡,维持内环境的稳定。脑中及体内多个组织和器官均存在独立的RAS系统,称为局部RAS系统。且与循环系统RAS的主要成分相似,局部RAS也可见Ang Ⅱ及其1型受体(AT1R)和2型受体(AT2R)的稳定表达。包括我课题组在内的不少先前实验已经发现,AngⅡ与帕金森病多巴胺能神经元的损伤紧密相关,且利用血管紧张素转换酶抑制剂(ACE inhibitors,ACEI)或 Ang Ⅱ 受体拮抗剂(Angiotensin Ⅱ receptor blockers,ARB)阻断Ang Ⅱ介导的信号通路可减少基底节区多巴胺能神经元的凋亡。此外,在诸如心脏、肾脏等组织或器官中,AngⅡ均可通过增强自噬活动以加剧心肌细胞和肾脏足细胞的凋亡,从而加强对心肌和肾脏的损伤,这提示细胞凋亡可能与自噬密不可分。因此,在本研究的第一部分,我们拟利用可以稳定表达AT1R和AT2R的Cath.a多巴胺能细胞株作为研究对象,分别观察Ang Ⅱ对神经元凋亡和自噬的影响以及神经元凋亡和自噬之间的关联,并进一步观察何种受体参与了 Ang Ⅱ引起前述效应的过程,从而阐明Ang Ⅱ对离体多巴胺能神经元的影响及相关机制。ARB类药物已被部分实验证明对多巴胺能神经元具有保护作用,而目前关于ARB类药物对PD动物模型病理学及行为学的影响及分子机制的研究较少。因此,在本研究的第二部分,我们首先利用鱼藤酮构建PD大鼠模型,观察黑质区AngⅡ和AT1R、AT2R含量的表达变化,以从活体层面初步探寻AngⅡ及其何种受体可能参与PD的病理进程。接着,通过外源性Ang Ⅱ和(或)一种AngⅡ受体拮抗剂氯沙坦连续一周对大鼠注射给药,观察Ang Ⅱ及氯沙坦对正常大鼠黑质区多巴胺能神经元凋亡的影响。最后,通过对鱼藤酮造模成功的PD大鼠进行阿齐沙坦(一种新型AT1受体拮抗剂)灌胃,观察阿齐沙坦对PD动物模型多巴胺能神经元及其PD症状的影响,以明确AT1受体拮抗剂在PD治疗中的保护作用。综上所述,本项目的完成不仅能从离体和活体层面探究Ang Ⅱ对多巴胺能神经元凋亡的影响,更能揭示PD的部分发病机制,从而为PD的预防与治疗提供新的靶点和理论依据。第一部分血管紧张素Ⅱ对多巴胺能神经元细胞株凋亡和自噬的影响及机制研究目的:研究Ang Ⅱ对Cath.a多巴胺能神经元细胞株凋亡和自噬的影响及相关机制。方法:本实验利用一种可以稳定表达AT1R和AT2R的多巴胺能细胞株—Cath.a细胞作为研究对象,(1)研究AngⅡ对细胞凋亡的影响:低、中、高不同浓度的Ang Ⅱ分别处理细胞后,采用蛋白免疫印迹法观察各组凋亡标志物cleaved caspase-3的蛋白表达,采用caspase 3活性检测试剂盒检测各组细胞caspase 3的活性,采用流式细胞仪测量各组细胞的凋亡率;(2)研究Ang Ⅱ对细胞自噬的影响:低、中、高不同浓度的Ang Ⅱ处理细胞后,采用蛋白免疫印迹法观察各组自噬标志物LC3-Ⅱ和p62的蛋白含量,采用免疫荧光法比较各组细胞LC3-Ⅱ的表达;(3)研究细胞凋亡和自噬间的关联:利用自噬抑制剂3-MA阻断Ang Ⅱ对细胞自噬的激活,观察自噬被抑制后,Ang Ⅱ对细胞凋亡标志物cleaved caspase-3及caspase 3活性的变化;(4)研究何种受体参与了 Ang Ⅱ的前述作用:利用AT1受体拮抗剂氯沙坦和AT2受体拮抗剂PD123319分别干预Ang Ⅱ介导的信号通路,观察AT1R和AT2R被阻断后,Ang Ⅱ对细胞凋亡标志物cleaved caspase-3、caspase 3活性以及自噬标志物LC3-Ⅱ和p62的变化。结果:与对照组相比,中、高浓度Ang Ⅱ可以明显增加Cath.a细胞cleaved caspase-3的蛋白表达、caspase 3活性及细胞凋亡率;与对照组相比,中、高浓度Ang Ⅱ可以显著增加Cath.a细胞LC3-Ⅱ的蛋白含量、降低p62的蛋白含量、增强LC3-Ⅱ在细胞的表达;自噬抑制剂3-MA可以完全阻断Ang Ⅱ对细胞自噬的激活,与此同时,Ang Ⅱ对细胞的凋亡作用也被完全抑制;AT1受体拮抗剂氯沙坦给药后,Ang Ⅱ对细胞的自噬和凋亡作用被完全逆转,而AT2受体拮抗剂PD123319对此并无显著影响。结论:(1)Ang Ⅱ可以增加多巴胺能神经元的凋亡和自噬活动;(2)AngⅡ对细胞凋亡的增强作用可通过激活自噬实现;(3)AT1受体而非AT2受体参与AngⅡ对细胞的上述作用。第二部分血管紧张素Ⅱ对帕金森病大鼠病理学及行为学的影响及机制研究目的:研究Ang Ⅱ对PD大鼠模型黑质区多巴胺能神经元的凋亡和对其PD症状的影响及相关机制。方法:本实验利用Lewis大鼠作为研究对象,(1)研究PD病理进程是否与RAS的过度激活有关:在鱼藤酮成功构建PD大鼠模型后,采用ELISA试剂盒、实时定量PCR法和蛋白免疫印迹技术检测大鼠黑质区Ang Ⅱ及其AT1R、AT2R的含量变化;(2)研究外源性Ang Ⅱ对正常大鼠黑质区多巴胺能神经元凋亡的影响及所依赖的受体:对大鼠右侧黑质区持续一周直接注射外源性Ang Ⅱ和(或)AT1R拮抗剂氯沙坦,采用免疫组化技术观察各组大鼠黑质区TH阳性细胞数,采用caspase-3活性试剂盒比较各组大鼠黑质区神经元的caspase-3活性;(3)研究新型AT1R拮抗剂阿齐沙坦对PD大鼠黑质区多巴胺能神经元凋亡和对其PD症状的影响:对鱼藤酮造模成功的PD大鼠进行阿齐沙坦灌胃,采用免疫组化技术和caspase-3活性试剂盒观察不同组大鼠黑质区神经元的凋亡情况,采用垂直网格实验及水平杠杆实验对各组大鼠行为学进行检测。结果:与对照组相比,PD大鼠组黑质区Ang Ⅱ及AT1R含量明显升高,而AT2R含量无明显变化;外源性Ang Ⅱ注射组相较对照组显著减少大鼠右侧黑质区TH阳性细胞的表达及增高其caspase-3活性,而Ang Ⅱ的上述作用在氯沙坦共同给药后被完全阻断;相较PD组,阿齐沙坦灌胃组大鼠黑质区TH阳性细胞明显增加、caspase-3活性明显降低,且大鼠的PD症状明显缓解。结论:(1)在鱼藤酮成功构建的PD大鼠模型中,脑内Ang Ⅱ/AT1轴的过度激活参与PD的发生发展;(2)—种新型AT1受体拮抗剂阿齐沙坦可以减少PD大鼠黑质区多巴胺能神经元的凋亡、缓解其PD症状,从而在PD的病理进程中起到保护作用。
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R742.5

【参考文献】