退变椎间盘终板软骨细胞衰老及调控机制研究

发布时间：2017-12-25 03:09

  本文关键词：退变椎间盘终板软骨细胞衰老及调控机制研究　出处：《重庆医科大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：目的:观察退变椎间盘终板软骨细胞衰老的表现以及氧化应激对终板软骨细胞衰老的影响,探讨SIRT1对氧化应激诱导的终板软骨细胞衰老的调控作用以及相关机制,为进一步揭示椎间盘软骨终板的退变机制提供相关实验基础。方法:取因腰椎爆裂骨折(LVF组,退变轻)及椎间盘退变性疾病(DDD组,退变严重),行椎间盘切除术的椎间盘组织分离得到终板软骨组织,进行大体标本观察、组织学检测(常规HE染色,免疫组织化学染色),观察不同退变程度终板软骨组织中细胞的外形及SIRT1、p53、p21、p16蛋白表达情况。提取原代终板软骨细胞,进行细胞扩增、培养;并采用致死量以下的H2O2进行氧化应激处理,观察对细胞的影响,构建细胞衰老模型;并采用流式细胞仪、衰老相关β-半乳糖苷酶染色、定量PCR、WB等方法检测细胞的凋亡、周期分布,以及细胞衰老相关信号通路的激活情况。构建高表达SIRT1的腺病毒Ad-SIRT1并验证其表达及功能,以ad-gfp为对照,并应用sirt1基因特异性抑制剂nicotinamide、p53特异性抑制剂pft-α,调控sirt1表达及衰老相关信号通路的活性后,采用流式细胞仪、衰老相关β-半乳糖苷酶染色、免疫荧光、定量pcr、wb等方法检测细胞的周期分布,以及衰老相关基因的表达的定位及定量情况。进而探讨sirt1对氧化应激诱导的终板软骨细胞衰老的调控作用及机制。结果:DDD组椎间盘终板软骨组织较lvf组颜色偏黄,钙化明显,he染色显示其大多细胞相对变扁,而lvf组细胞相对成圆形。免疫组织化学提示ddd组sirt1阳性细胞率较lvf组明显减少(p0.05),而ddd组p53、p21的阳性细胞率较lvf组明显增加(p0.05),而p16的阳性细胞率两组中尚未见明显差异(p0.05),ddd组原代细胞中衰老相关β-半乳糖苷酶染色阳性细胞率明显高于lvf组(p0.05)。致死量以下H_2O_2进行氧化应激处理终板软骨p2代细胞后,两组(control组、H_2O_2组)细胞凋亡率未见明显差异(p0.05),而细胞周期中g1期细胞的比例H_2O_2组明显高于control组(p0.05),且衰老相关β-半乳糖苷酶染色阳性细胞率H_2O_2组明显高于control组(p0.05),并且H_2O_2组中ii型胶原的表达明显降低,而mmp13的表达明显增高;p53乙酰化水平及p21的mrna及蛋白水平H_2O_2组都明显高于control组(p0.05),p38磷酸化水平及p16的mrna及蛋白水平H_2O_2组与control组未见明显差异(p0.05)。腺病毒过表达sirt1后,H_2O_2+ad-sirt1组较对照组(H_2O_2组)明显抑制p53乙酰化水平及抑制p21的表达(p0.05),同时降低β-半乳糖苷酶染色阳性细胞率(p0.05),并使得细胞周期中g1期细胞的比例明显降低(p0.05);而H_2O_2+nic组抑制sirt1的表达后,较对照组(H_2O_2组)明显增加了p53乙酰化水平及p21的表达(p0.05),衰老相关β-半乳糖苷酶染色阳性细胞率增高(p0.05),同时细胞周期中g1期细胞的比例明显增高(p0.05)。在氧化应激条件,细胞免疫荧光染色提示sirt1定位于细胞核内,而p53出现明显向细胞核内聚集,进一步提示sirt1与p53可能存在相互作用。而H_2O_2+nic+pft-α组在氧化应激下使用nic抑制sirt1,激活p53/p21信号通路后,再使用p53特异性抑制剂pft-α后,p21的表达水平较H_2O_2+nic组明显降低(p0.05),同时衰老相关β-半乳糖苷酶染色阳性细胞率降低(p0.05),细胞周期中g1期细胞的比例也明显降低(p0.05),同时与单纯氧化应激诱导细胞衰老后直接加入pft-α即H_2O_2+pft-α组比较,p21的表达水平、衰老相关β-半乳糖苷酶染色阳性细胞率、g1期细胞的比例并无明显统计学差异。进一步提示p53/p21是sirt1调控氧化应激条件下终板软骨细胞衰老的重要信号通路。结论:退变椎间盘终板软骨细胞存在明显衰老表型,而氧化应激条件下p53/p21信号通路在终板软骨细胞衰老调控中有着重要的作用,sirt1可通过p53/p21信号通路缓解氧化应激诱导的细胞衰老,这为进一步探讨椎间盘终板软骨的退变提供相关实验基础。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R681.53

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本文编号：1331093