miR-421通过靶向组蛋白赖氨酸去甲基化酶5A调控卵巢癌增殖、迁移和侵袭的初步研究

发布时间：2017-12-26 19:05

本文关键词：miR-421通过靶向组蛋白赖氨酸去甲基化酶5A调控卵巢癌增殖、迁移和侵袭的初步研究　出处：《郑州大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景:在所有的妇科恶性肿瘤里,上皮性卵巢癌是死亡率最高的一种。近年来,随着对卵巢癌研究的深入,卵巢癌的治疗也有了长足发展。先行肿瘤细胞减灭术(满意的),接着使用紫杉醇和铂类为主的联合化疗,这是目前卵巢癌的标准治疗方案。这种治疗方案虽然改善了初治卵巢癌的预后,但其总体生存率仍无明显改善,III期和Ⅳ期(晚期卵巢癌)患者的5年生存率仍仅仅只有29%和13%,这与卵巢癌化疗耐药及侵袭转移有关。因此,研究卵巢癌发生发展过程的分子机制,可以为寻找新的有效的治疗方法提供理论基础,在改善卵巢癌患者的预后方面具有重要的临床意义。肿瘤靶向基因治疗是针对肿瘤组织有别于正常组织的特征,通过分子生物学技术将目的基因靶向导入特定的组织细胞或在特定的组织细胞中靶向表达,修复缺陷基因或抑制致瘤基因,从而在不影响正常细胞的情况下,使肿瘤细胞生长受到抑制。因此,与传统的化疗相比,肿瘤靶向基因治疗具有特异性强,疗效明确,副作用低等优点,具有广阔的应用前景。肿瘤靶向基因治疗的三大靶点包括细胞生长因子受体、细胞内信号传导系统以及新生血管。目前应用于卵巢癌分子靶向制剂主要包括ErbB受体家族抑制剂(吉非替尼,西妥昔单抗等)、VEGF受体家族抑制剂(贝伐单抗,索拉菲尼等)、诱导凋亡及逆转耐药制剂(如TLK-286,P-gp抑制剂等)、PDGF和c-Kit抑制剂(格列卫)及基因治疗(P53基因治疗)等。然而,上述分子靶向制剂在前期临床研究中治疗效果欠佳,其原因之一是由于在肿瘤的发生发展的过程中,往往有多个抑癌基因的失活,在肿瘤治疗过程中,针对单一基因的治疗常常不足以抑制肿瘤的生长。因此,探索卵巢癌发生发展的多因素环节,寻找新的治疗靶标有可能为卵巢癌的治疗提供新的选择。表观基因机制是指基因的功能或表达水平在基因组序列不变的情况下发生可遗传的改变。主要包括:DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑和RNA干扰等。表观遗传修饰针对整个基因组而不是特定的基因,其调节可同时恢复多个抑癌基因的表达,并降低基因突变的发生率,提高基因组稳定性,可能为肿瘤分子靶向治疗提供新的靶点。随着对表观基因改变的认识,将表观基因药物与基因药物连用将是肿瘤治疗的一个新的起点。组蛋白赖氨酸去甲基化酶(histone lysine demethylase genes,KDMs)在肿瘤的发生发展中发挥重要的作用。其可通过催化去除组蛋白N末端赖氨酸残基上的甲基,而组蛋白去甲基化状态调控着基因的表达,参与染色质功能的调节,这是一种重要的表观遗传学调控方式。去甲基化主要发生在组蛋白H3、H4的多个赖氨酸位点上,从而介导基因的激活或者沉默。因此当KDMs的表达发生变化时,其会随之导致组蛋白的去甲基化状态也发生相应的改变,从而发生某个或某些基因的异常沉默或者激活。在恶性肿瘤的发生发展过程中,这一系列的变化往往与之密切相关,也贯穿于癌症的各个阶段。因此,癌症在一定程度上是一种表观遗传疾病。KDM5A又称RBP2或JARID1A,是KDMs家族的一个重要成员,它能特异性地作用于组蛋白的H3的第4位赖氨酸位点(H3K4me3)上,对其作用,使之发生去甲基化修饰。KDM5A是由于在2007年之前,KDM5A以pRb结合蛋白的方式为人所知,因此又称RBP2。它由ARID(即AT-rich interaction domain)、JmjN、JmjC、non-T/E1A、C5HC2、LXCXE尾部和2~3个PHD结构域构成。其中KDM5A的特异性去甲基化酶活性区是JmjN和JmjC;ARID可与DNA CCGCCC尾部发生结合,从而导致靶基因转录翻译受到抑制,进一步影响肿瘤的发生和发展的过程。KDM5A可通过多种途径在肿瘤的发生发展中发挥作用。2010年,Zeng J等研究发现:KDM5A在胃癌里过表达,并与胃癌细胞的增殖与衰老关系密切;应用RNA干扰技术沉默KDM5A能够激活细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂,从而诱导胃癌细胞衰老,调控胃癌细胞的增殖。同时,KDM5A可以通过激活Akt信号通路上调N-cadherin和Snail的表达水平,或者直接与ITGBβ1(整合素β1)的启动子进行结合,从而调控癌细胞的恶性生物学行为,如侵袭和转移等。KDM5A还参与促进肺癌细胞增殖、迁移和侵袭转移,主要是通过上调细胞周期蛋白如:cyclin D1和integrinβ1的表达。同时,肿瘤细胞耐药也同样存在KDM5A的参与。Jinling Hou等研究发现,KDM5A在乳腺癌中的过表达与乳腺癌细胞化疗耐药相关。通过应用shRNAs抑制乳腺癌细胞的KDM5A的基因表达,导致了H3K4甲基化程度增加和CDKIs激活,提高了EGFR(epidermal growth factor receptor)抑制剂的抗肿瘤效果,从而提示KDM5A可作为乳腺癌的潜在治疗靶点。但KDM5A在卵巢癌发生发展中的作用与分子机制目前尚未见报道。microRNA(即微小RNA,miRNA)是一种内源性非编码小RNA,长度约为18-25nt,进化上高度保守。mi RNA通过与靶基因的互补结合,导致靶基因的切割及翻译抑制,从而调控靶基因的表达。mi RNA对靶基因的调控并不是一一对应的,一个miRNA可直接调控约两百个靶mRNA,同时多个miRNA也可调控同一个靶基因。人类基因组内含有的miRNA可达到上千个,可调控将近33%的蛋白编码基因。近年来,越来越多的研究表明,miRNAs在肿瘤发生和进展中起到了重要的作用,约50%的mi RNAs与多种人类肿瘤相关。这并不是一个偶然事件,从目前的研究来看,有许多已证实功能的miRNA,这些miRNA在不同肿瘤中所起的作用各不相同,即可能作为致癌基因起作用,也可能作为抑癌基因发挥作用,参与肿瘤发生进展及转移的各个阶段。近年来,miRNA在转录后水平对于基因的调控一直是研究的热点之一。近年来,miRNAs在卵巢癌发生发展中的作用也受到越来越多的关注。有研究通过应用微阵列芯片或大规模并行测序技术,发现卵巢癌中存在一系列异常上调或下调的miRNAs。但miRNAs的下调更为常见,尤其是在晚期和高级别病变中。虽然目前卵巢癌中miRNA差异表达谱并没有得到一致的研究结果,但仍然有一些miRNA在多个研究中被发现具有相同的异常表达模式。例如,let-7是一个明确的抑癌miRNA,它在几乎所有上皮性卵巢癌的miRNA表达谱研究中都呈现下调的表现,其靶基因包括胚胎基因HMAG2、Mlin-41和IMP-1和著名的癌基因ras。因为在癌变早期往往有胚胎间充质基因的重新表达,与胚胎发育过程类似,因此let-7表达下调造成的癌细胞去分化很有可能是上皮性卵巢癌发生的早期因素。不同的是,上皮间质转化(EMT,epithelial-mesenchymal transition)是在上皮性卵巢癌发生种植转移的过程中的重要机制之一。miR-200是EMT的关键调控者,miR-200表达的下降伴随着上皮性卵巢癌转移的发生,这个过程是miR-200通过其靶基因——两个E盒结合转录因子ZEB1和ZEB2,来调节E-钙粘蛋白的表达而实现的。这些研究结果均提示miR-200下调在上皮性卵巢癌的进展、转移阶段发挥作用。此外,还有一些调控细胞调亡(如miR-34s)或增殖(如miR-143)的miRNA的异常表达通过引起肿瘤细胞增殖凋亡平衡而促进上皮性卵巢癌的发生、发展。可见,上皮性卵巢癌中miRNA的表达异常与DNA拷贝数改变、表观遗传因素、转录因子调控及miRNA加工蛋白的变化等机制有关。最近研究发现,miRNA可以靶向KDMs家族,从而参与调控肿瘤的发生及侵袭转移。近日,杜克大学王小凡教授发现缺氧诱导的miR-215通过抑制表观遗传调控因子KDM1B及调节多条信号通路的活性,重编程胶质瘤起始细胞(Glioma-initiating cells,GICs)适应了这种缺氧微环境,对胶质瘤的发生、发展及转移起到了至关重要的作用。因此深入研究miRNA与KDMs家族在卵巢癌中的表达状况及相互作用,对研究卵巢癌的发生、发展和转移的机制具有重要意义,并将有利于卵巢癌的诊断、治疗及预后判断。目前,国内外尚无KDM5A与卵巢癌相关关系的研究报道,且其上游由哪种miRNA调控也未见相关报道。miR-421靶向KDM5A是否参与卵巢癌的发生发展、其与卵巢癌细胞的生物学行为关系如何、其对卵巢癌的临床意义何在等问题尚不清楚。第一部分KDM5A在卵巢癌组织中的表达和临床意义以及分子机制研究目的:评估KDM5A在卵巢癌中表达的临床意义以及和临床特征及预后的关系,然后进一步研究KDM5A在卵巢癌增殖侵袭转移中的调节作用及其分子机制。方法:1.对卵巢癌基因表达谱进行挖掘(利用BRB-Arraytools基因芯片分析软件),下载GEO及TCGA公共数据库中的卵巢癌基因芯片数据,分析KDM5A在卵巢癌组织与正常卵巢组织中的表达情况。并结合其临床随访数据,分析KDM5A在卵巢癌组织中的表达与临床病理特征及预后之间的关系。2.从郑州大学第一附属医院妇科收集51例卵巢癌和51例正常卵巢组织的组织标本,并提取总RNA,应用Realtime-PCR方法检测51例卵巢癌组织和51例正常卵巢组织中的KDM5A中的mRNA表达水平。3.卵巢癌组织中的KDM5A蛋白表达强度应用组织芯片技术检测,并分析KDM5A表达与卵巢癌患者临床因素及患者预后之间的关系。4.将靶向KDM5A的siRNA转染至卵巢癌细胞系OVCAR-8和SKOV-3,利用RNAi技术沉默KDM5A,研究其对卵巢癌细胞的生长、凋亡、迁移和侵袭的生物学行为的影响。5.数据的统计分析采用GraphPad Prism 5软件进行,数据采用均数±标准差。两组数据间的比较采用的方法为Mann-Whitney’s检验或双侧Student’s t-test。总生存期分析方法为Kaplan-Meier survival curves,以α=0.05作为检验水准。结果:1.生物信息学分析KDM5A在卵巢癌组织中的表达:与正常卵巢组织对比,卵巢癌组织中KDM5A mRNA表达水平呈显著升高(P㩳0.0006)(GEO公共基因数据库)。KDM5A低表达的卵巢癌患者的生存时间明显好于KDM5A高表达的患者(TCGA公共基因数据库),提示KDM5A的过表达和卵巢癌患者的临床预后密切相关。2.临床标本验证KDM5A mRNA表达:对临床收集的卵巢癌组织和正常卵巢组织各51例中检测发现:卵巢癌组织中KDM5A mRNA表达水平明显升高,差异有统计学意义(P㩳0.05)。3.临床标本检测KDM5A蛋白表达:根据卵巢癌组织芯片的分析结果我们发现,卵巢癌组织中KDM5A的蛋白表达水平明显增高。Kaplan-Meier分析结果显示卵巢癌组织中KDM5A的表达水平与患者的临床预后密切相关,单因素分析结果显示KDM5A的表达与FIGO分期(P=0.012)、淋巴结转移(P=0.005)有关,而与年龄(P=0.937)、组织学类型(P=0.841)、病理分级(P=0.686)无明显相关。4.功能学验证:KDM5A基因敲减后,卵巢癌细胞系的增殖、迁移和侵袭能力均明显下降,细胞成瘤能力受到显著抑制;凋亡率明显升高。结论1.KDM5A在卵巢癌中表达水平明显高于正常卵巢组织;2.KDM5A的高表达与卵巢癌患者的FIGO分期、淋巴结转移以及患者预后明显相关,表明KDM5A在卵巢癌发生发展过程中可能发挥了重要作用;3.沉默KDM5A的表达后,卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力均明显抑制,同时可诱导卵巢癌细胞的凋亡。第二部分靶向KDM5A的miRNA的筛选鉴定及其调控卵巢癌增殖的分子机制研究目的:利用生物信息学技术筛选和鉴定可能靶向KDM5A的miRNA,进一步研究KDM5A在卵巢癌中异常表达的上游分子机制。方法:1.通过在线预测工具(Targetscan,miRanda,miRwalk)计算分析预测能够靶向KDM5A的miRNAs的集合,筛选出潜在的可能靶向KDM5A的miR-421,并与临床收集的51例卵巢癌和51例正常卵巢组织中的miR-421的表达水平检测相结合。2.利用TCGA数据库中卵巢癌的mi RNA芯片表达谱及其随访数据,分析卵巢癌组织中miR-421的表达与卵巢癌预后的关系。3.过表达mi R-421后,在卵巢癌细胞中检测KDM5A mRNA和蛋白表达水平变化,并观察卵巢癌细胞的增殖及侵袭能力的变化。4.通过双荧光素酶报告实验,对miR-421靶向KDM5A的负性调控作用进行验证。5.数据的统计分析应用GraphPad Prism 5,数据应用均数±标准差表示。组间数据的比较方法为Mann-Whitney’s检验或双侧Student’s t-test。总生存期的分析方法采用Kaplan-Meier survival curves,以α=0.05作为检验水准。结果:1.通过生信学分析发现,miR-421可能靶向调控KDM5A;并且利用RT-PCR检测发现,卵巢癌组织中miR-421的表达水平显著降低(P0.0001),进一步通过荧光素酶报告实验证实miR-421含有KDM5A结合位点的萤光报告基因的活性。2.通过Kaplan-Meier分析显示:miR-421的表达水平与卵巢癌患者预后明显相关(P=0.016),mi R-421低表达的卵巢癌患者,其生存时间差于高表达者,提示miR-421的表达水平与卵巢癌患者预后密切相关。3.miR-421过表达可对KDM5A表达水平有明显影响。mi R-421过表达后,与KDM5A敲除有相似的效果,可导致卵巢癌细胞系的增殖及侵袭能力明显下降。初步表明miR-421对KDM5A的负性靶向调控可在转录后水平进行,从而参与卵巢癌的侵袭和转移。结论:1.miR-421在卵巢癌中低表达,其可能是抑癌基因。miR-421的表达水平和卵巢癌患者的临床预后密切相关。2.miR-421能够特异性的靶向结合KDM5A基因,miR-421/KDM5A调节轴在卵巢癌的发生和发展中可能起到了重要的作用。第三部分miR-421对卵巢癌生物学行为影响的体内研究目的:进一步研究miR-421靶向KDM5A在体内对裸鼠体内卵巢癌移植瘤生长的影响。方法:1.将miR-421稳定过表达组(Lenti-miR-421)和空病毒对照组(Lenti-mock)的卵巢癌细胞接种于裸鼠皮下,观察miR-421对卵巢癌生物学行为的体内影响。2.观察并记录裸鼠体积和重量,观察miR-421稳定过表达组(Lenti-miR-421)和空病毒对照组(Lenti-mock)裸鼠肿瘤体积和重量的变化,绘制肿瘤生长曲线。3.RT-PCR技术检测裸鼠肿瘤组织中的miR-421及KDM5A的表达;免疫组织化学技术检测裸鼠肿瘤组织的KDM5A和Ki67的表达。4.统计学分析利用GraphPad Prism 5进行。基因表达强度与之间的相关性采用Pearson’s相关分析进行;总生存曲线用Kaplan-Meier法,所有实验结果均以P0.05为有统计学意义。结果:1.转染Lenti-miR-421裸鼠肿瘤组织中的miR-421的表达显著上升(P0.05);和转染空病毒(Lenti-mock)的裸鼠组相比,过表达miR-421(Lenti-miR-421)后卵巢癌增殖速度明显减慢,肿瘤体积减少。2.免疫组化证实过表达miR-421后KDM5A表达降低,KDM5A的表达和miR-421的表达呈负相关;肿瘤增殖标志物Ki67表达降低。结论:1.过表达miR-421后卵巢癌细胞在体内增殖速度明显减慢。2.KDM5A是miR-421的下游直接靶基因,miR-421通过靶向KDM5A而抑制卵巢癌增殖。全文结论1.卵巢癌组织中KDM5A的表达明显升高,其高表达与患者的FIGO分期、淋巴结转移等临床恶性表型明细相关,且其高表达和患者的预后密切相关,可见KDM5A在卵巢癌的发生和发展过程中起到促癌基因作用;2.miR-421在卵巢癌中表达明显降低,其低表达与患者的预后密切相关。提示在卵巢癌的发生和发展过程中miR-421可能起到抑癌基因的作用;3.miR-421能够特异性的结合KDM5A的3’UTR区,通过负性调节KDM5A的蛋白表达,参与卵巢癌的进展;4.在卵巢癌的发生发展中,miR-421/KDM5A调节轴起到了重要作用,未来有望成为卵巢癌靶向治疗的新靶点。
[Abstract]:Background: in all gynecologic malignancies, epithelial ovarian cancer is the highest death rate. In recent years, with the in-depth study of ovarian cancer, the treatment of ovarian cancer has also made considerable progress. Tumor cell subtraction (satisfactory), followed by combined chemotherapy based on paclitaxel and platinum, is the standard treatment for ovarian cancer. Although the regimen improved the prognosis of newly diagnosed ovarian cancer, the overall survival rate was not improved. The 5 year survival rate of III and stage IV ovarian cancer patients is only 29% and 13%, which is related to chemotherapy resistance, invasion and metastasis of ovarian cancer. Therefore, studying the molecular mechanism of ovarian cancer development and development can provide a theoretical basis for finding new effective therapies, and has important clinical significance in improving the prognosis of ovarian cancer patients. Tumor targeted gene therapy for tumor tissue has characteristic different from the normal tissue, using molecular biology technique to gene targeting into specific cells or in specific tissue and cell targeting expression, gene repair defects or inhibit the tumorigenic gene, which does not affect normal cells, tumor cell growth inhibition. Therefore, compared with traditional chemotherapy, tumor targeting gene therapy has the advantages of strong specificity, clear curative effect and low side effect, and has a broad application prospect. The three major targets of tumor targeting gene therapy include cell growth factor receptor, intracellular signal transduction system, and neovascularization. Currently used in molecular targeted agents of ovarian cancer including ErbB receptor family inhibitors (gefitinib and cetuximab), VEGF receptor inhibitor family (bevacizumab, Sola Feeney), induce apoptosis and reverse drug resistance agents (such as TLK-286, P-gp, PDGF inhibitor) and c-Kit inhibitors (Gleevec) and gene therapy (P53 gene therapy). However, the molecular targeted therapy agents in pre clinical studies in the poor, one of the reasons is due to the tumor development process, often with multiple tumor suppressor gene inactivation, in cancer treatment, treatment for a single gene is often not enough to inhibit the growth of tumor. Therefore, to explore the multiple factors in the development of ovarian cancer and to find new therapeutic targets may provide a new choice for the treatment of ovarian cancer. Epigenetic mechanism refers to a genetic change in the function or expression level of a gene in the absence of a genomic sequence. It mainly includes DNA methylation, histone modification, chromatin remodeling and RNA interference. Epigenetic modification is aimed at the whole genome rather than a specific gene. Its regulation can restore multiple tumor suppressor genes at the same time, reduce the incidence of gene mutation and improve genome stability, which may provide new targets for molecular targeted therapy of cancer. With the understanding of epigenetic changes, the combination of epigenetic and gene drugs will be a new starting point for cancer treatment. The histone lysine demethylation enzyme (histone lysine demethylase genes, KDMs) plays an important role in the development of tumor. It can catalyze the removal of methyl group on the lysine residues of histone N terminal, and histone demethylation state regulates gene expression and participates in the regulation of chromatin function, which is an important epigenetic regulation mode. Demethylation occurs mainly on the multiple lysine sites of histone H3 and H4, which mediates the activation or silence of the gene. Therefore, when the expression of KDMs changes, it will lead to a corresponding change in the demethylation state of histone, resulting in the abnormal silence or activation of one or some genes. In the course of the development of malignant tumors, this series of changes is often closely related to the various stages of cancer. Therefore, cancer is, to a certain extent, an epigenetic disease. KDM5A, also known as RBP2 or JARID1A, is an important member of KDMs family. It can act specifically on the fourth lysine site (H3K4me3) of histone H3, and make it demethylation. KDM5A was known as KDM5A in the way of pRb binding protein before 2007, so it was also called RBP2. It consists of ARID (that is, AT-rich interaction domain), JmjN, JmjC, non-T/E1A, C5HC2, LXCXE tail, and 2~3 PHD domains. The specific demethylation activity area of KDM5A is JmjN and JmjC. ARID can bind to the tail of DNA CCGCCC, resulting in the inhibition of target gene transcription and translation, further affecting the process of tumor occurrence and development. KDM5A can play a role in the development of cancer in a variety of ways. In 2010, Zeng J found that: the overexpression of KDM5A in gastric cancer, and gastric cancer cell proliferation and senescence related closely; silencing KDM5A by RNA interference can activate the cyclin dependent kinase inhibitor, which induced senescence of gastric cancer cells, regulating the proliferation of gastric cancer cells. Meanwhile, KDM5A can upregulate the expression level of N-cadherin and Snail through activating Akt signaling pathway, or directly bind to the promoter of ITGB beta 1 (integrin beta 1), thereby regulating the malignant biological behavior of cancer cells, such as invasion and metastasis. KDM5A is also involved in promoting the proliferation, migration and invasion of lung cancer cells, mainly by up regulation of the expression of cyclin, such as cyclin D1 and integrin beta 1. At the same time, the drug resistance of tumor cells is also involved in KDM5A. Jinling Hou and other studies have found that the overexpression of KDM5A in breast cancer is associated with chemoresistance in breast cancer cells. The inhibition of KDM5A gene expression in breast cancer cells by shRNAs inhibited the degree of H3K4 methylation and CDKIs activation, and increased the antitumor effect of EGFR (epidermal growth factor receptor) inhibitor, suggesting that KDM5A can be used as a mammary gland.
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R737.31

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